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Har Gobind Khorana wurde von hinduistischen Eltern in Raipur geboren, einem kleinen Dorf im Punjab, der heute zu Ostpakistan gehört. Das korrekte Datum seiner Geburt ist nicht bekannt; in Dokumenten ist der 9. Januar 1922 angegeben. Er ist das jüngste Kind einer Familie mit einer Tochter und vier Söhnen. Sein Vater war ein „patwari“, ein dörflicher landwirtschaftlicher Steuerbeamter im britisch-indischen Regierungssystem. Obwohl er arm war, widmete sich sein Vater der Erziehung seiner Kinder, und sie waren praktisch die einzige gebildete Familie in dem von etwa 100 Menschen bewohnten Dorf.
Har Gobind Khorana besuchte die D.A.V. High School in Multan (heute West Punjab); Ratan Lal, einer seiner Lehrer, beeinflusste ihn während dieser Zeit sehr. Später studierte er an der Punjab Universität in Lahore, wo er einen M. Sc. erhielt. Mahan Singh, ein großer Lehrer und akkurater Experimentalphysiker, war sein Doktorvater.
Khorana lebte bis 1945 in Indien, als ihm ein Stipendium der indischen Regierung die Möglichkeit gab, nach England zu gehen und an der Universität Liverpool zu promovieren. Roger J. S. Beer betreute seine Forschungen und kümmerte sich darüber hinaus gewissenhaft um ihn. Es war die Einführung von Khorana in die westliche Zivilisation und Kultur.
Khorana verbrachte ein Postdoc-Jahr (1948-1949) an der Eidgenössischen Technischen Hochschule in Zürich bei Professor Vladimir Prelog. Die Zusammenarbeit mit Professor Prelog prägte unermesslich sein Denken und seine Philosophie gegenüber Wissenschaft, Arbeit und Anstrengung.
Nach einem kurzen Aufenthalt in Indien im Herbst 1949 kehrte Khorana nach England zurück, wo er ein Stipendium erhielt, um mit Dr. (jetzt Professor) G. W. Kenner und Professor (jetzt Lord) A. R. Todd zu arbeiten. Er blieb von 1950 bis 1952 in Cambridge. Auch dieser Aufenthalt war für Khorana von entscheidendem Wert. Das Interesse sowohl an Proteinen als auch an Nukleinsäuren wurde in dieser Zeit geweckt.
Ein Stellenangebot von Dr. Gordon M. Shrum aus British Columbia (heute Kanzler der Simon Fraser University, British Columbia) führte ihn 1952 nach Vancouver. Das British Columbia Research Council bot damals nur wenig Ausstattung, dafür aber „alle Freiheiten der Welt“, um es mit den Worten von Dr. Shrum zu sagen, um das zu tun, was der Forscher gerne tun wollte. In den folgenden Jahren begann eine Gruppe unter der Inspiration und Ermutigung von Dr. Shrum und der häufigen Hilfe und wissenschaftlichen Beratung von Dr. Jack Campbell (heute Leiter der Abteilung für Mikrobiologie an der University of British Columbia), auf dem Gebiet der biologisch interessanten Phosphatester und Nukleinsäuren zu arbeiten. Unter den vielen hingebungsvollen und loyalen Kollegen dieser Zeit ist insbesondere Dr. Gordon M. Tener (heute Professor in der Abteilung Biochemie der University of British Columbia) zu erwähnen, der viel zum geistigen und intellektuellen Wohlergehen der Gruppe beitrug.
Im Jahr 1960 wechselte Khorana an das Institut für Enzymforschung an der University of Wisconsin. Er wurde eingebürgerter Bürger der Vereinigten Staaten. Seit Herbst 1970 ist Khorana Alfred P. Sloan Professor für Biologie und Chemie am Massachusetts Institute of Technology.
Har Gobind Khorana war seit 1952 mit Esther Elizabeth Sibler verheiratet, die aus der Schweiz stammt. Esther brachte einen beständigen Sinn in sein Leben zu einer Zeit, als Khorana sich nach sechs Jahren Abwesenheit von seinem Geburtsland überall fehl am Platz und nirgends zu Hause fühlte. Sie haben drei Kinder: Julia Elizabeth (geboren am 4. Mai 1953), Emily Anne (geboren am 18. Oktober 1954) und Dave Roy (geboren am 26. Juli 1958).