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Har Gobind Khorana nació de padres hindúes en Raipur, un pequeño pueblo del Punjab, que ahora forma parte del este de Pakistán. No se conoce la fecha correcta de su nacimiento; la que figura en los documentos es el 9 de enero de 1922. Es el menor de una familia con una hija y cuatro hijos. Su padre era un «patwari», un funcionario de impuestos agrícolas de la aldea en el sistema de gobierno de la India británica. Aunque era pobre, su padre se dedicó a educar a sus hijos y eran prácticamente la única familia alfabetizada del pueblo habitado por unas 100 personas.
Har Gobind Khorana asistió a la escuela secundaria D.A.V. en Multan (actual Punjab Occidental); Ratan Lal, uno de sus profesores, tuvo una gran influencia en él durante ese periodo. Más tarde, estudió en la Universidad de Punjab, en Lahore, donde obtuvo una maestría. Mahan Singh, un gran profesor y preciso experimentalista, fue su supervisor.
Khorana vivió en la India hasta 1945, cuando la concesión de una beca del Gobierno de la India le permitió ir a Inglaterra y estudió el doctorado en la Universidad de Liverpool. Roger J. S. Beer supervisó su investigación y, además, se ocupó de él con diligencia. Fue la introducción de Khorana a la civilización y la cultura occidentales.
Khorana pasó un año postdoctoral (1948-1949) en la Eidgenössische Technische Hochschule de Zúrich con el profesor Vladimir Prelog. La asociación con el profesor Prelog moldeó inconmensurablemente su pensamiento y filosofía hacia la ciencia, el trabajo y el esfuerzo.
Después de un breve período en la India en el otoño de 1949, Khorana regresó a Inglaterra donde obtuvo una beca para trabajar con el Dr. (ahora profesor) G. W. Kenner y el profesor (ahora Lord) A. R. Todd. Permaneció en Cambridge desde 1950 hasta 1952. Una vez más, esta estancia resultó ser decisiva para Khorana. El interés por las proteínas y los ácidos nucleicos se afianzó en esa época.
Una oferta de trabajo en 1952 del Dr. Gordon M. Shrum de la Columbia Británica (actual rector de la Universidad Simon Fraser, Columbia Británica) le llevó a Vancouver. El Consejo de Investigación de la Columbia Británica ofrecía entonces muy pocas facilidades, pero había «toda la libertad del mundo», en palabras del Dr. Shrum, para hacer lo que el investigador quisiera. Durante los años siguientes, con la inspiración y el estímulo del Dr. Shrum y la ayuda y el asesoramiento científico frecuentes del Dr. Jack Campbell (actual director del Departamento de Microbiología de la Universidad de Columbia Británica), un grupo comenzó a trabajar en el campo de los ésteres de fosfato y los ácidos nucleicos de interés biológico. Entre los muchos colegas devotos y leales de este periodo, hay que mencionar en particular al Dr. Gordon M. Tener (ahora profesor del Departamento de Bioquímica de la Universidad de la Columbia Británica), que contribuyó mucho al bienestar espiritual e intelectual del grupo.
En 1960 Khorana se trasladó al Instituto de Investigación Enzimática de la Universidad de Wisconsin. Se convirtió en ciudadano naturalizado de los Estados Unidos. Desde el otoño de 1970, Khorana es profesor Alfred P. Sloan de Biología y Química en el Instituto Tecnológico de Massachusetts.
Har Gobind Khorana se casó en 1952 con Esther Elizabeth Sibler, de origen suizo. Esther aportó a su vida un sentido coherente en una época en la que, tras seis años de ausencia del país en el que nació, Khorana se sentía fuera de lugar en todas partes y en casa en ninguna. Tienen tres hijos: Julia Elizabeth (nacida el 4 de mayo de 1953), Emily Anne (nacida el 18 de octubre de 1954) y Dave Roy (nacido el 26 de julio de 1958).