Genes Homeobox en Embriogénesis y Patogénesis

La palabra griega «homeo» significa parecido, y los genes homeóticos (o HOM) de Drosophila se denominan así por su capacidad, cuando mutan, de transformar un segmento del cuerpo del insecto en parecido a otro. Por ejemplo, los mutantes de pérdida de función del gen Ultrabithorax (Ubx) conducen a la transformación del tercer segmento torácico portador de halterios (pequeños equilibradores, véase la Fig. 1) hacia un segundo segmento torácico con alas, generando así moscas de cuatro alas (revisado en las Ref. 1 y 4). Los trabajos pioneros de E. B. Lewis(5) demostraron que la función normal de los genes homeóticos es asignar identidades espaciales (o posicionales) distintas a las células en diferentes regiones a lo largo del eje anteroposterior de la mosca, y que es la combinación de genes homeóticos (o código homeótico) expresada en una célula dada la que le «dice» que pertenece a la cabeza, el tórax o el abdomen de la mosca.

Los genes Hox de los mamíferos se definen en virtud de su homología con los genes del complejo homeótico (HOM-C) de Drosophila. El análisis de los genes Hox de ratón y humanos indica que hay al menos 39 de ellos organizados en cuatro grupos, HoxA, HoxB, HoxC y HoxD, cada uno localizado en un cromosoma diferente (por ejemplo, los cromosomas humanos 7, 17, 12 y 2, respectivamente), y que comprenden 9-11 genes (Fig. 1). Sobre la base de las similitudes de secuencia y la posición relativa en el complejo, los genes Hox individuales dentro de los diferentes grupos pueden alinearse entre sí y con los genes del grupo HOM-C de Drosophila. Estas similitudes sugieren que los cuatro clusters de mamíferos probablemente surgieron de un único complejo ancestral, anterior a la divergencia entre artrópodos y cordados hace 600 millones de años, primero por la expansión del cluster a través de la duplicación lateral de genes (causada, por ejemplo, por el cruce desigual durante la meiosis) y segundo, durante la transición de cefalocordados a vertebrados, a través de la duplicación de los clusters por duplicación cromosómica o poliploidización .

En los embriones de mamíferos, la expresión más temprana de los genes Hox se puede detectar en la gastrulación. Los genes Hox se expresan en las tres capas germinales con dominios superpuestos que se extienden desde el extremo caudal del embrión hasta un marcado límite anterior que es específico para cada gen Hox. Los genes Hox se disponen en el mismo orden a lo largo de los cromosomas que se expresan a lo largo del eje anteroposterior del embrión, es decir, los genes que se sitúan 5′ en los clusters se expresan más posteriormente, mientras que los genes situados más 3′ se expresan progresivamente en regiones más anteriores. Significativamente, esta correlación, denominada «colinealidad espacial», también es válida para los genes homeóticos de Drosophila (revisado enRef. 6)(Fig. 1).

Genes Hox en el patrón del esqueleto axial. En ausencia de cualquier mutación natural obvia en los genes Hox de los vertebrados, fue el desarrollo de los ratones transgénicos y las tecnologías de selección de genes lo que permitió la generación de mutaciones de ganancia de función y de pérdida de función en la línea germinal del ratón(7, 8).

En Drosophila, la expresión ectópica de un gen homeótico a menudo resulta en transformaciones homeóticas posteriores. Por ejemplo, los mutantes de ganancia de función de Ubx (Fig. 1) conducen a la transformación del segundo en el tercer segmento torácico con la transformación de las alas en un segundo par de halterios. De forma similar, la expresión ectópica del gen Antennapedia (Antp) resultante de una inversión cromosómica espontánea, que coloca la región codificadora de proteínas de este gen bajo el control de un promotor heterólogo, conduce a la conversión de la antena en patas mesotorácicas (segundo segmento torácico) (revisado enRef. 1). La primera evidencia de una conservación evolutiva funcional de los genes Hox de los mamíferos fue proporcionada por dos experimentos de ganancia de función realizados por M. Kessel et al.(9) en el Instituto Max Planck de Göttingen y por T. Lufkin et al.(10) en nuestro grupo. Construimos un transgén en el que la secuencia codificadora de Hoxd-4 se había fusionado con la región promotora del gen Hoxa-1. Este constructo se integró en el genoma del ratón. En embriones de ratón de tipo salvaje, Hoxd-4 se expresa hasta el nivel del quinto somito, que participa en la formación del atlas (C1 en la Fig. 2D). La colocación de Hoxd-4 bajo el control de los elementos reguladores cis de Hoxa-1 impulsa su expresión en un dominio anterior ectópico que abarca los cuatro somitos occipitales, que normalmente se fusionan para formar los huesos basi- y exoccipitales (B y E en la Fig. 2D). En los recién nacidos transgénicos del «promotor de Hoxa-1-Hoxd-4» (Hoxd-4+), los huesos exoccipitales son reemplazados por una a cuatro estructuras osificadas ectópicas (A1-A4) que se asemejan a los arcos neurales de las vértebras, y el basioccipital, normalmente un hueso plano, adquiere una forma cilíndrica que recuerda a un cuerpo vertebral (B* en la Fig. 2E)(10). Así, la expresión ectópica de Hoxd-4 conduce a transformaciones homeóticas posteriores, de forma similar a las mutaciones de ganancia de función de genes homeóticos en Drosophila. Este experimento también proporcionó pruebas de que al menos parte de la red de genes HOM/Hox ha sido cooptada para impartir identidades morfológicas a estructuras segmentadas en grupos de animales que emplean estrategias de desarrollo radicalmente diferentes, y que algún aspecto de la función de los genes se ha conservado desde la divergencia de los artrópodos y los cordados. Esta conservación filogenética de la función se ve reforzada por la capacidad de rescatar mutaciones de pérdida de función en el gen homeótico de Drosophila por medio de los genes Hox . También cabe destacar que las malformaciones observadas en los ratones que expresan Hoxd-4 de forma ectópica corresponden a características normales de los agnatos, los vertebrados más primitivos, que tenían vértebras occipitales en lugar de huesos occipitales. Que el cambio en la expresión de un solo gen Hox sea suficiente para inducir un cambio atávico puede ayudar a comprender los acontecimientos genéticos que han sido decisivos en la evolución de la forma de los vertebrados actuales a partir de otros más primitivos (revisado enRef. 12).

Hasta la fecha, también se han descrito numerosas mutaciones de pérdida de función en los genes Hox de mamíferos (revisado enRef. 13). La estrategia consiste en la interrupción dirigida del gen por recombinación homóloga. En resumen, un alelo de tipo salvaje se sustituye por un alelo no funcional en el genoma de una célula ES, que luego se inyecta en un blastocisto de ratón para generar una quimera, de la que se derivan animales mutantes a través de la transmisión en línea germinal de la mutación. En los últimos años, más de la mitad de los genes Hox han sido inactivados funcionalmente. En la mayoría de estos estudios, el fenotipo mutante nulo comprendía al menos una transformación vertebral, como por ejemplo «occipitalización» del atlas (por ejemplo, inactivación de Hoxd-3; Fig. 2F)(14); transformación del eje a una identidad del atlas evidenciada por la formación de un arco ventral a nivel de la segunda vértebra cervical (por ejemplo inactivación de Hoxb-4)(15); conversión de la primera vértebra lumbar en una vértebra torácica, produciendo así un decimocuarto par de costillas supernumerario (p. ej. inactivación de Hoxc-8)(16); transformación del primer sacro en una vértebra lumbar (p. ej, inactivación de Hoxd-11)(17, 18). Cabe destacar que las transformaciones axiales casi siempre se corresponden con anteriorizaciones tales que la vértebra(e) transformada adquiere la morfología de su vecina anterior de tipo salvaje. Del mismo modo, las mutaciones de pérdida de función de los genes homeóticos en la mosca de la fruta conducen a transformaciones homeóticas de los segmentos corporales hacia un destino anterior (véase más arriba). Además, los ratones mutantes nulos para un determinado gen Hox suelen mostrar transformaciones homeóticas en la región más anterior en la que ese gen Hox se expresa normalmente, y no dentro de las regiones en las que se expresa un gen más 5′.

En conjunto, los resultados de las mutaciones de ganancia y pérdida de función apoyan la noción de una jerarquía de la función de los genes homeóticos tanto en ratones como en moscas: en general, las proteínas Hox y homeóticas de acción más posterior son dominantes con respecto a la función sobre las proteínas de acción más anterior. Este fenómeno, que se ha denominado «dominancia posterior» (o «prevalencia posterior») en los ratones y «supresión fenotípica» en las moscas, sugiere que el programa morfogenético en un nivel determinado del eje corporal principal está dictado por el más posterior (es decir, el más localizado en 5′).e. más 5′-localizado en el cluster) Hox o gen homeótico expresado en ese nivel axial(revisado enRef. 6).

El reciente análisis de dobles y triples mutantes Hox ha llevado a una revisión parcial del modelo de «prevalencia posterior» de la función de los genes Hox. Se ha integrado un aspecto cuantitativo en el modelo(6), que tiene en cuenta la posibilidad de que la duplicación en tándem y la tetraploidización de los genes Hox en los mamíferos podrían haber dado lugar a funciones parcialmente redundantes(18-22): El hecho de que la inactivación de un solo gen Hox dé lugar a transformaciones vertebrales sólo en su dominio de expresión más anterior puede reflejar el hecho de que es cuantitativamente preponderante en esta región; sin embargo, la interrupción simultánea de otras dos (o más) proteínas Hox expresadas en el mismo nivel axial, pero presentes individualmente en menor cantidad, puede dar lugar al mismo fenotipo. Por lo tanto, es más probable que la especificación vertebral se logre por la cooperación funcional de una «combinación» de genes Hox expresados en un nivel axial determinado (la combinatoria Hox(23)) que por la función de un solo gen.

Genes Hox en la morfogénesis de las extremidades y en el patrón de los tractos reproductivo y digestivo. La familia de genes Hox de los mamíferos contiene 15 genes relacionados con el gen de Drosophila, Abd-B(Fig. 1). Además de sus dominios de expresión a lo largo de la columna prevertebral, la mayoría de estos genes relacionados con Abd-B se expresan con dominios superpuestos en las extremidades anteriores y posteriores en desarrollo, lo que es coherente con un papel en la especificación del patrón de los dígitos(24). De hecho, los experimentos de knock-out de genes murinos relacionados con el Abd-B dieron como resultado la reducción del tamaño, cambios en la forma y/o retraso en la osificación de los elementos esqueléticos tanto de las extremidades anteriores (por ejemplo, Hoxd-9, Hoxd-9, Hoxd-11)(17, 21, 25, 26) como de las posteriores (por ejemplo, Hoxa-10)(18). Estos resultados indican que estos genes controlan inicialmente la asignación y el crecimiento de las condensaciones precondrogénicas y, posteriormente, la secuencia de osificación de los modelos de cartílago (revisado enRef. 13). Sin embargo, nunca se observaron transformaciones homeóticas. Por ejemplo, la disrupción del gen Hoxd-13, que se expresa específicamente en el territorio de los presuntos dígitos, provoca el truncamiento de la mayoría de los huesos metacarpianos y metatarsianos, el acortamiento o la ausencia de ciertas falanges, así como la formación de un rudimento de dígito supernumerario en el miembro anterior(27)(Fig. 3, A y B). La interrupción dirigida de Hoxa-13 dio lugar a un fenotipo autopodal, distinto del de su parálogo Hoxd-13, incluyendo la falta del primer dígito tanto en las extremidades delanteras como en las traseras y la alteración de algunos elementos del carpo/del tarso, lo que sugiere que estos dos genes no son funcionalmente equivalentes para el desarrollo autopodal(28).

Por otra parte, los fenotipos mutantes compuestos de Hox también han revelado funciones redundantes parciales en el patrón de las extremidades, como para la especificación vertebral (ver arriba), entre genes paralógicos(28, 29) y no paralógicos(18). Por ejemplo, los mutantes compuestos Hoxa-13/Hoxd-13 mostraron alteraciones del crecimiento y del patrón de los autópodos mucho más severas que las observadas en cada mutante individual (es decir, falta casi completa de patrón condrogénico; Fig. 3, A-C), lo que demuestra que estos productos génicos también pueden compensarse parcialmente entre sí(28).

Recientemente se han descrito dos anomalías hereditarias de las extremidades en humanos, causadas por mutaciones en los genes HOXD13 y HOXA13(30, 31). La sinpolidactilia humana es un síndrome semidominante y resulta de la inserción en el marco de tramos cortos de poli(alanina) en la región N-terminal de HOXD13(30). Curiosamente, el fenotipo de la extremidad humana es más grave (tanto en el estado homocigoto como en el heterocigoto) que el fenotipo de la disrupción del gen Hoxd-13 en ratones(27) (Fig. 3, A y B). Por otra parte, las anormalidades de las extremidades sinpolíticas se asemejan a las observadas en los mutantes compuestos Hoxa-13/Hoxd-13(28)(Fig. 3C). Una explicación molecular plausible es que la proteína humana mutada es inactiva desde el punto de vista de la transcripción, pero mantiene todas sus propiedades de unión al ADN, por lo que presenta propiedades negativas dominantes. A través de la ocupación del sitio de unión, puede interferir con las funciones de otras homeoproteínas normalmente implicadas en la morfogénesis de los dígitos, como por ejemplo HOXA13, dando lugar a alteraciones más graves que las debidas únicamente a la inactivación de Hoxd-13(28, 32). El síndrome mano-pie-genital humano es un síndrome autosómico dominante debido a una mutación sin sentido en el homeodominio HOXA13(31), que afecta principalmente al primer dígito (tanto el pulgar como el dedo gordo del pie), así como al desarrollo del conducto mülleriano, ureteral y uretral (causando útero didélfico o bicorne, aperturas ureterales ectópicas e hipospadias). El hecho de que los heterocigotos para la mutación nula de Hoxa-13 en el ratón muestren defectos aparentemente menos graves que los observados en el síndrome mano-pie-genital apoya la sugerencia anterior de que la mutación de HOXA-13 da lugar a una proteína que ejerce un efecto negativo dominante(31) (X. Warot, C. Fromental-Ramain, P. Chambon y P. Dollé, observaciones no publicadas).

Varios estudios han revelado las funciones de otros genes Hox relacionados con Abd-B en el tracto genitourinario en desarrollo y en la parte terminal del tracto digestivo. Los mutantes nulos de Hoxa-10, tanto masculinos como femeninos, son hipofértiles. Los sujetos masculinos mutantes presentan criptorquidia, causada por una formación anormal del canal inguinal y por un fallo en el acortamiento del gubernaculum(33, 34). Además, muestran una malformación del conducto deferente que se asemeja a una transformación homeótica parcial en un epidídimo(35). En los mutantes nulos de Hoxa-11 también se observa una homeosis parcial de los conductos deferentes hacia una morfología similar a la del epidídimo(36). Curiosamente, las hembras mutantes de Hoxa-10 muestran una transformación anterior a un nivel correspondiente del tracto reproductivo, ya que la parte proximal del útero se transforma en una estructura similar al oviducto(35). Estos datos indican claramente una función importante de algunos genes Hox en la definición de los destinos regionales a lo largo del eje anteroposterior de los conductos de Wolff y de Müller.

También se encontró que los genes murinos más «posteriores», Hoxd-12 y Hoxd-13, tienen una función específica en la morfogénesis de la parte terminal del tracto digestivo. De hecho, los mutantes nulos de Hoxd-12 y Hoxd-13 muestran una desorganización de las capas de músculos lisos que forman el esfínter anal interno, lo que da lugar a un prolapso rectal en algunos mutantes(37).

Genes Hox en el patrón del rombencéfalo y el desarrollo craneofacial. El rombencéfalo, o romboencéfalo, se divide transitoriamente a lo largo de su eje anteroposterior en una serie de segmentos (siete en el ratón y el hombre) llamados rombómeros(38). Esta organización segmentaria del rombencéfalo determina la migración segmentaria del NCC desde el neurectodermo para poblar y modelar los arcos faríngeos. Los análisis de hibridación in situ han revelado que, en general, parte de la combinación de genes Hox expresada en un determinado rombómero también se expresa en el NCC que migra desde ese rombómero, lo que sugiere que los genes Hox pueden ser fundamentales en el patrón de la región branquial de la cabeza (revisado enRef. 39).

Para validar esta hipótesis, nosotros y otros inactivamos funcionalmente el gen Hoxa-2(40, 41). Los NCC que emigran de los dos primeros rombómeros y del mesencéfalo caudal normalmente pueblan el primer arco (o maxilomandibular), donde dan lugar a los huesos dentario, maxilar, escamoso, timpánico, malleus e incus y al cartílago de Meckel. Los NCC que emanan del cuarto rombómero normalmente pueblan el segundo arco (o hioides) y forman el estribo, el hueso estiloide y el cuerno menor del hueso hioides. Hoxa-2 es el gen Hox «más anterior», ya que es el único miembro de esta familia que se expresa en el segundo rombómero. Sin embargo, a este nivel del eje anteroposteior su expresión está restringida al neurectodermo; así, los NCC del primer arco faríngeo no expresan ningún gen Hox. En cambio, Hoxa-2 se expresa en el NCC del segundo arco faríngeo. En los fetos nulos de Hoxa-2, el esqueleto derivado del NCC del segundo arco faríngeo carece selectivamente (por ejemplo, el estribo, Fig. 2, A-C). En el lugar de los elementos esqueléticos del segundo arco, está presente un conjunto ectópico caudal de elementos esqueléticos del primer arco, en su mayor parte como imagen especular de su homólogo ortotópico. Este conjunto ectópico comprende: 1) dentro de la región del oído medio, un yunque supernumerario, un martillo, un cartílago de Meckel truncado y un hueso timpánico (Fig. 2, A-C); 2) fuera de la región del oído medio, un pequeño hueso escamoso supernumerario(40). Estos datos del análisis esquelético, combinados con los datos de expresión génica, indican que la disrupción del gen Hoxa-2 da lugar a una transformación homeótica de la identidad del segundo al primer arco faríngeo. Dicha transformación revela que el programa morfogenético del NCC derivado de los dos primeros rombómeros corresponde a un programa de patrón esquelético (GPP) básico (o por defecto) que es común al NCC mesenquimal de, al menos, el primer y segundo arco faríngeo, y que no requiere la expresión del gen Hox. En los ratones de tipo salvaje, el GPP es reespecificado por Hoxa-2, que, al igual que los genes homeóticos de Drosophila, actúa como un gen selector para producir el segundo programa morfogenético específico del arco. Curiosamente, una estructura esquelética atávica correspondiente al cartílago de la mandíbula superior de los reptiles (o pterygoquadrate) se desarrolla a partir del segundo arco de los mutantes de Hoxa-2 (Fig. 2C); así, en ausencia de este gen, el segundo arco NCC parece ejecutar una GPP que corresponde a la de la fase terápsida de la evolución de los mamíferos(12, 40).

Estudios adicionales de inactivación también apoyaron papeles importantes de los genes Hox en el patronaje de los arcos posteriores del cerebro y la faringe. Por ejemplo, la inactivación dirigida de Hoxa-3 provoca hipoparatiroidismo e hipoplasia tímica y tiroidea(42). Curiosamente, estos defectos también se observan en el síndrome de Di George (que, sin embargo, no se debe a una mutación del gen Hox) . En los mutantes nulos de Hoxa-1 se encontraron defectos de los rombómeros 4 y 5, anomalías del nervio craneal y del oído interno(44, 45), y en los ratones knockout de Hoxb-1 y Hoxb-2 se observaron deficiencias selectivas del núcleo motor del nervio facial(46-48). Las características de estos fenotipos, como la parálisis de los músculos faciales, se asemejan a las de la parálisis de Bell y los síndromes de Moebius en humanos.

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