Le caratteristiche dello Staphylococcus aureus Small Colony Variant isolato dalla mastite cronica in una fattoria nella provincia di Yunnan, Cina
Abstract
Staphylococcus aureus è uno dei principali agenti causali della mastite bovina e ha caratteristiche fonotipiche specifiche, tra cui la piccola colonia, la crescita lenta e la ridotta emolisi, per cui è stato chiamato SCV (Small Colony Variants). Su 30 campioni analizzati dei casi di S. aureus cronico, è stato isolato un ceppo di SCVs (S. aureus SCV22) insieme ai suoi ceppi parentali (S. aureus11). S. aureus SCV22 ha mostrato un tasso di crescita lento se confrontato con il ceppo parentale. Tuttavia, i loro modelli di resistenza erano simili. Nel frattempo, S. aureus SCV22 ha mostrato un tasso inferiore di apoptosi nelle cellule epiteliali mammarie bovine. Questi risultati del presente studio hanno presentato le caratteristiche uniche di S. aureus SCV22 per la prima volta nella provincia dello Yunnan, che ha fornito una base di partenza per ulteriori studi sulla patogenesi di S. aureus SCV nella mastite cronica.
1. Introduzione
La mastite bovina è molto diffusa tra le vacche da latte, principalmente causata dallo Staphylococcus aureus patogeno, con un’enorme perdita economica nella produzione casearia. Un’ipotesi proposta per la prima volta da Proctor et al. ha dimostrato che l’infezione cronica o ricorrente era associata a S. aureus SCVs . Prima della scoperta degli SCV di S. aureus, S. aureus era generalmente considerato un batterio extracellulare. Tuttavia, molti nuovi rapporti hanno mostrato che S. aureus SCVs possedeva la capacità di persistere intracellularmente in fagociti non professionali, come le cellule epiteliali, fibroblasti, osteoblasti e cellule endoteliali .
Al meglio della nostra conoscenza, nessun rapporto è stato documentato per l’isolamento di S. aureus SCVs da vacche da latte nella provincia di Yunnan, Cina sud-ovest, così come la ricerca relativa. Lo scopo di questo studio era quello di esplorare la persistenza intracellulare, l’apoptosi delle cellule epiteliali mammarie e la creazione di un modello di mastite in S. aureus SCVs, e i risultati avrebbero fornito le basi per conoscere meglio i meccanismi di infezione di S. aureus SCVs nella mastite cronica in ulteriori studi.
2. Materiali e metodi
2.1. Isolamento e identificazione di S. aureus e SCVs dal latte
Campioni di latte crudo () sono stati raccolti in modo asettico da mucche con alimentazione sparsa in una fattoria lattiera nella città di Kunming nella provincia dello Yunnan. Di conseguenza, tutti i campioni sono stati coltivati su Trypticase Soy Agar (TSA, HUANKAI, Guangzhou, Cina) integrato con 5% di sangue di pecora (Ruite, Guangzhou, Cina) e poi coltivati a 37°C per 24 h e 48 h, rispettivamente. S. aureus è stato identificato in base alle caratteristiche fonotipiche di essere grande, cremoso e fortemente emolitico su TSA con 5% di sangue di pecora. Sono state anche raccolte colonie di potenziali SCVs minuscole, non pigmentate e non emolitiche su TSA con il 5% di sangue di pecora. Gli isolati di potenziali SCV sono stati subcoltivati su TSA per dieci generazioni per valutare la loro stabilità. Gli SCV e i loro ceppi parentali sono stati testati principalmente per le proprietà biochimiche di routine; poi i potenziali SCV sono stati identificati come SCV di S. aureus con il gene (nuc, nucA, e 16srDNA) mediante amplificazione PCR multipla (Tabella 1). Lo S. aureus SCV identificato e i suoi ceppi parentali sono stati denominati rispettivamente S. aureus SCV22 e S. aureus11. Tutti gli isolati sono stati conservati a -80°C in Trypticase Soy Broth (TSB, HUANKAI) integrato con 25% di glicerina (HUANKAI) per ulteriori indagini.
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2.2. Auxotrophism Assay
Il test di auxotropia degli SCV è stato eseguito su agar Mueller-Hinton (MHA, Difco BD, Pechino, Cina) con 1 μg/mL di emina (Sigma, Shanghai, Cina), 1 μg/mL di timidina (Sigma), 1 μg/mL di bisolfito di sodio menadione (Sigma), e 100 μg/mL di tiamina come descritto precedentemente. Auxotrophism SCVs sono stati identificati, che ha mostrato la crescita simile ai loro ceppi parentali dopo incubazione durante la notte a 37°C.
2.3. Curve di crescita batterica
Le SCV e i loro ceppi parentali sono stati analizzati in triplicato per le caratteristiche della curva di crescita. I ceppi crioconservati sono stati inoculati in 10 mL di brodo TSB per una notte a 37°C. 1 mL di coltura notturna è stato trasferito in una beuta contenente 200 mL di TSB e quindi incubato a 37°C su un agitatore rotante (150 rpm). La crescita batterica è stata determinata misurando la OD 600 nm ogni 4 ore.
2.4. Cultura cellulare
Tutti i reagenti sono stati acquistati da Biological Industries (BI, Israele). Le cellule epiteliali mammarie primarie bovine (Procell, Wuhan, Cina) sono state coltivate in un terreno di crescita per cellule epidermiche integrato con 10% di siero fetale di vitello (FCS, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania), fattore di crescita epidermico (0,1 ng/mL), insulina suina e idrocortisone. Le cellule congelate sono state rianimate nella piastra di coltura cellulare con il pezzo di arrampicata cellulare in anticipo. Le MEC sono state utilizzate dopo 3 passaggi per i rispettivi esperimenti.
2.5. Esperimenti di infezione
Per gli esperimenti di infezione, i batteri di S. aureus SCV22 e S. aureus11 sono stati coltivati per una notte a 37°C su TSA integrato con 5% di sangue di pecora, raccogliendo una singola colonia da coltivare in terreno liquido per 4 h, poi raccogliendo i batteri, sospendendoli con DMEM/F12 (sigma), e poi regolando la concentrazione dei talli a 108 ufc/mL. Quando le cellule sono cresciute all’80%, una cella è stata infettata con 100 batteri. Il test di infezione è stato terminato dopo 3 h.
2.6. Apoptosi
Le cellule infettate sono state colorate con il kit Annexin V-FITC/PI (Beyotime, Shanghai, Cina). La quantità di cellule in apoptosi è stata misurata tramite citometria a flusso (BD FACSCalibur, USA) e analizzata con il software Cellquest Pro.
2.7. Microscopia elettronica a scansione
Le cellule infettate sono state lavate 5 volte con PBS e le cellule sono state fissate con tampone fosfato glutaraldeide. Poi la disidratazione delle cellule è stata eseguita per 15 minuti in ogni soluzione usando un etanolo graduato dal 30% al 100%. La scalata delle cellule è stata essiccata secondo il metodo di essiccazione del punto critico prima di essere rivestita d’oro in un E-1010 Ion Sputter Coater (Hitachi, Giappone). Infine, il cambiamento delle cellule epiteliali mammarie è stato osservato da un microscopio elettronico a scansione S-3000N (Hitachi, Giappone).
2.8. Il test di persistenza intracellulare
L’esperimento di infezione è stato condotto nuovamente e incubato per 3 ore a 37°C con 5% CO2 per permettere la fagocitosi e l’adesione di S. aureus SCV22 e S. aureus11. La piastra cellulare testata è stata lavata con PBS sterile e sono stati aggiunti 100 mg/mL di gentamicina e 50 mg/mL di penicillina, rispettivamente. La piastra cellulare è stata lavata di nuovo e lisostafina è stato aggiunto per eliminare i batteri extracellulari e poi incubato per 30 min, 3 h, 9 h e 12 h, rispettivamente. Ad ogni punto di tempo, le cellule sono state lavate tre volte con PBS per rimuovere la lisostafina, che è stata seguita dall’aggiunta di 50 μL 0,25% Triton X-100 per disperdere le cellule epiteliali e rilasciare i batteri intracellulari. Il reagente per lisare le cellule è stato diluito con acqua sterile. 100 mL di diluente sono stati sparsi sulla piastra AGAR. Il numero di unità formanti colonie intracellulari (CFU) è stato contato dopo che S. aureus SCV22 e SASCV11 erano cresciuti per una notte a 37°C ad ogni punto temporale.
2.9. Test di suscettibilità antimicrobica
La suscettibilità antimicrobica di S. aureus SCV22 è stata determinata rigorosamente con 10 antibiotici secondo le istruzioni del kit di suscettibilità ai farmaci (Tianhe), mentre il ceppo standard di S. aureus (ATCC29213, Tianhe, Hangzhou, Cina) è stato usato come controllo di qualità (QC).
3. Risultati
3.1. Isolamento e identificazione di S. aureus11 e S. aureus SCV22 dal latte
Su 30 campioni raccolti da mucche da latte Holstein, sono stati trovati 8 isolati di sospetto tipico S. aureus11. Sono stati subcoltivati a 37°C per 16 ore su TSA con 5% di sangue di pecora. Il risultato ha mostrato che tutti gli isolati hanno mostrato le tipiche caratteristiche morfologiche come (4 mm) β colonie emolitiche e cremose (Figura 1(b)), e i batteri erano coccus Gram-positivi e disposti come grappoli d’uva al microscopio ottico. Inoltre, il test della catalasi su TSA puro incubato a 37°C per 16 ore era fortemente positivo. La prevalenza della coagulasi era del 100% con il kit commerciale (Staphylase Test Kit, Oxoid, Beijing, China).
(a)(a)
(b)(b)
(a)
Su otto isolati di S. aureus, uno era SCV22 putativo. Le colonie di SCV11 con pinpoint (0,3 mm) non erano pigmentate e non presentavano una leggerissima emolisi fino all’incubazione per 24 ore a 37°C su TSA con 5% di sangue di pecora (Figura 1(a)). Al microscopio ottico, questi potenziali SCV11 sembravano essere identici ai tipici S. aureus. Per SCV11, anche il test della catalasi era positivo, mentre la coagulasi non veniva rilevata. Nel corso di un passaggio continuo per dieci generazioni questi risultati erano stabili fino al passaggio di 10 generazioni.
Tutti gli isolati erano positivi al test PCR multiplo (Figura 2). L’analisi della sequenza di 16S rRNA ha mostrato che il gene di S. aureus SCV22 e dei suoi ceppi parentali sono omologhi alla sequenza pubblicata di S. aureus.
3.2. L’analisi dell’auxotrofismo di S. aureus SCV22 ha rivelato una dipendenza dalla timidina; i ceppi di auxotrofismo erano vicini ai loro ceppi genitori su MHA con 1 μg/mL di timidina. Tuttavia, lo S. aureus SCV22 era negativo per l’emina, il menadione e la tiamina (Figura 3).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
Figura 3
Saggio di auxotrofismo: piccole varianti di colonia S. aureus SCV22 (a), i loro ceppi parentali (b), e i ceppi di auxotrofismo (c).
3.3. Curve di crescita batterica
Secondo le curve di crescita di S. aureus SCV22 e dei loro ceppi parentali (di seguito S. aureus11) coltivati in TSB puro, S. aureus11 ha mostrato una tipica curva di crescita batterica. Al contrario, S. aureus SCV22 ha mostrato una curva di crescita lineare, che aveva una fase di ritardo estesa, ma il confine tra la fase di ritardo e la fase log non poteva essere distinto a causa di nessun punto di rottura mostrato nella Figura 4.
Figura 4
Curve di crescita di piccole varianti di colonia S. aureus SCV22 in Trypticase Soy Broth rispetto ai loro ceppi parentali.
3.4. Test intracellulare
I test per S. aureus SCV22 e S. aureus11 sono stati fatti in triplicato per confrontare e quantificare la loro capacità di persistere intracellularmente all’interno della linea di cellule epiteliali mammarie primarie bovine. La misurazione di CFU è stata condotta ai punti temporali di 0,5 h, 3 h, 9 h e 12 h, rispettivamente (Figura 5). In questo modo, la prevalenza di persistenza dal punto di tempo di 3 ore stava diventando diversa tra S. aureus SCV22 e S. aureus11, e il numero di CFU di S. aureus SCV22 era relativamente stabile (Figura 6).
Figura 5
(40x) Cambiamenti morfologici che indicano danno cellulare, distacco e arrotondamento delle cellule epiteliali mammarie primarie bovine infettate con piccole varianti di colonia di S. aureus SCV22 e i loro ceppi parentali dopo 0,5 ore (a1, b1), 3 ore (a2, b2), 9 ore (a3, b3), e 12 ore (a4, b4). S. aureus11 è stato presentato in (a1), (a2), (a3), e (a4); S. aureus SCV22 è stato presentato in (b1), (b2), (b3), e (B4).
Figura 6
S. aureus SCV22 M CFU/mL (1 milione di unità formanti colonie/mL) recuperate da cellule epiteliali mammarie bovine primarie in diversi punti temporali rispetto a S. aureus11.
3.5. Apoptosi
Rispetto al gruppo di controllo, i tassi di apoptosi delle cellule epiteliali mammarie primarie bovine nei gruppi di infezione di S. aureus SCV22 e S. aureus11 sono aumentati significativamente (), e la differenza tra i gruppi S. aureus SCV22 e i gruppi S. aureus11 era anche statisticamente significativa () (Figura 7).
(a)
(a)
(b)
(b)
(a)
(b)
Figura 7
Varianti di piccole colonie S. aureus SCV22 e il loro ceppo parentale S. aureus11 hanno indotto l’apoptosi delle cellule epiteliali mammarie primarie bovine (a, b). Ci sono state differenze significative tra S. aureus SCV22 e il controllo. C’è una differenza molto significativa tra S. aureus11 e il controllo.
3.6. Microscopia elettronica a scansione
Al microscopio elettronico, le cellule di controllo sono cresciute normalmente. Nei gruppi di infezione da S. aureus11, le cellule sono diventate un pezzo rotondo e si sono ammassate insieme dopo essere cadute, la loro citomembrana si è rotta e il nucleo non è stato in grado di distinguere perché raggrinzito. Le cellule dei gruppi di infezione da S. aureus SCV22 tendevano a sfaldarsi, ma la membrana cellulare era intatta e non è stato trovato alcun extravaso di citoplasma (Figura 8).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
Figura 8
Micrografie elettroniche a scansione rappresentative hanno mostrato i vari effetti dell’apoptosi (controlli (g, h, e i), piccole varianti di colonia S. aureus SCV22 (d, e, e f), e il loro ceppo parentale S. aureus11 (a, b, e c), 5000x (c, f, e i), 2000x (b, e, e h), e 500x (a, d, e g)). Le frecce in (b, c, e, f, h, e i) rappresentano la morfologia della citomembrana.
3.7. Test di suscettibilità antimicrobica
L’ATCC25923 era sensibile a 10 antibiotici. Al contrario, lo S. aureus SCV22 aveva una resistenza a sei antibiotici; gli stessi risultati sono stati dati in test ripetuti (Tabella 2).
Antibiotico
ATCC 25923
S. aureus SCV22
Fosfomicina
S
S
SXT
S
R
Oxacillina
S
S
Ampicillina
S
R
Vancomicina
S
R
Streptomicina
S
R
Vancomicina
S
S
Ampicillina
S
R
Oxacillina
S
S
Gentamicina
S
R
S: sensibile; R: resistente.
SXT: sulfametoxazolo trimetoprim.
Tabella 2
Test di sensibilità di ATCC 25923 e S. aureus SCV22 isolati.
4. Discussioni
La mastite bovina è molto comune nella maggior parte degli allevamenti di mucche causata da S. aureus, specialmente la mastite cronica. Molti rapporti hanno dimostrato che una piccola variante di colonia di S. aureus con particolari caratteristiche fonotipiche è il principale batterio patogeno che porta alla mastite cronica. Nel presente studio, anche se S. aureus SCV22 e S. aureus11 avevano diverse caratteristiche fenotipiche e curve di crescita, i loro frammenti mirati erano gli stessi mediante amplificazione multipla PCR.
Da quando il fenomeno SCVs è stato trovato dai ceppi di Eberthella typhosa da Jacobsen nel 1910, sono stati riportati vari SCVs da diversi batteri. Tra questi, S. aureus SCVs sono stati selvaggiamente studiati, le loro caratteristiche principali sono piccole colonie, crescita lenta, formando biofilm, sopravvivendo nelle cellule ospiti cronicamente, e anche riducendo la sensibilità agli antibiotici, che sono coerenti con i nostri risultati, di cui fenotipo piccolo e crescita lenta di SCVs sono principalmente causati da difetti metabolici, e due tipi possono essere divisi, tra cui difetto di trasferimento di elettroni e difetto di sintesi della timina. Il primo è il tipico auxotrofo; il fenotipo normale può essere formato fornendo menadione o emina. In questo studio, il risultato ha mostrato che S. aureus SCV22 era S. aureus SCV dipendente dalla timina; questo tipo era stato riportato da pazienti con fibrosi cistica (CF) in precedenza.
Nel presente studio, S. aureus SCV22 aveva un’alta resistenza a SXT, mentre i loro ceppi parentali erano sensibili. SXT può interferire con la sintesi dell’acido tetraidrofolico per inibire la crescita di S. aureus. Per resistere a SXT, gli SCV timina-dipendenti hanno assorbito la timina in extracellulare e sono sopravvissuti alla fine. Questo fenomeno degli SCV timina-dipendenti può essere legato alla mutazione per interruzione del gene thyA, perché la timidilica sintetasi dell’acido e l’acido tetraidrofolico codificati dal gene sono coenzima importante per la timidilica sintetasi dell’acido.
In questo studio, i risultati del saggio intracellulare, del test di apoptosi e della microscopia elettronica a scansione hanno indicato che gli SCV di S. aureus hanno persistito più a lungo nei fagociti non professionali senza danni profondi, come precedentemente riportato. Questa caratteristica ha evitato con successo l’immunità dell’ospite e la terapia antibiotica che spiegava in parte la sua resistenza agli antibiotici e il fallimento della risposta immunitaria anticorpo-mediata (AMIR).
In conclusione, la mastite cronica è diffusa negli allevamenti di mucche nello Yunnan probabilmente a causa della libera circolazione, della tecnologia di produzione obsoleta, della mancanza di personale tecnico e dell’abuso di antibiotici. Nello studio, gli SCV di S. aureus isolati dalle mucche da latte sono stati riportati per la prima volta nello Yunnan, che sono fortemente collegati alla mastite cronica. Ad oggi, non esiste un trattamento per eliminare completamente la mastite cronica nella produzione; quindi, ulteriori studi dovrebbero essere condotti per conoscere meglio i meccanismi di infezione di S. aureus SCVs nella mastite cronica.
Conflitto di interessi
Non c’è conflitto di interessi.
Riconoscimento
Questa ricerca è stata supportata dal progetto della Chinese National Natural Science Foundation (31260629).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
3.3. Curve di crescita batterica
Secondo le curve di crescita di S. aureus SCV22 e dei loro ceppi parentali (di seguito S. aureus11) coltivati in TSB puro, S. aureus11 ha mostrato una tipica curva di crescita batterica. Al contrario, S. aureus SCV22 ha mostrato una curva di crescita lineare, che aveva una fase di ritardo estesa, ma il confine tra la fase di ritardo e la fase log non poteva essere distinto a causa di nessun punto di rottura mostrato nella Figura 4.
3.4. Test intracellulare
I test per S. aureus SCV22 e S. aureus11 sono stati fatti in triplicato per confrontare e quantificare la loro capacità di persistere intracellularmente all’interno della linea di cellule epiteliali mammarie primarie bovine. La misurazione di CFU è stata condotta ai punti temporali di 0,5 h, 3 h, 9 h e 12 h, rispettivamente (Figura 5). In questo modo, la prevalenza di persistenza dal punto di tempo di 3 ore stava diventando diversa tra S. aureus SCV22 e S. aureus11, e il numero di CFU di S. aureus SCV22 era relativamente stabile (Figura 6).
3.5. Apoptosi
Rispetto al gruppo di controllo, i tassi di apoptosi delle cellule epiteliali mammarie primarie bovine nei gruppi di infezione di S. aureus SCV22 e S. aureus11 sono aumentati significativamente (), e la differenza tra i gruppi S. aureus SCV22 e i gruppi S. aureus11 era anche statisticamente significativa () (Figura 7).
(a)(a)
(b)(b)
(a)
3.6. Microscopia elettronica a scansione
Al microscopio elettronico, le cellule di controllo sono cresciute normalmente. Nei gruppi di infezione da S. aureus11, le cellule sono diventate un pezzo rotondo e si sono ammassate insieme dopo essere cadute, la loro citomembrana si è rotta e il nucleo non è stato in grado di distinguere perché raggrinzito. Le cellule dei gruppi di infezione da S. aureus SCV22 tendevano a sfaldarsi, ma la membrana cellulare era intatta e non è stato trovato alcun extravaso di citoplasma (Figura 8).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
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(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
3.7. Test di suscettibilità antimicrobica
L’ATCC25923 era sensibile a 10 antibiotici. Al contrario, lo S. aureus SCV22 aveva una resistenza a sei antibiotici; gli stessi risultati sono stati dati in test ripetuti (Tabella 2).
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| S: sensibile; R: resistente. SXT: sulfametoxazolo trimetoprim. |
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4. Discussioni
La mastite bovina è molto comune nella maggior parte degli allevamenti di mucche causata da S. aureus, specialmente la mastite cronica. Molti rapporti hanno dimostrato che una piccola variante di colonia di S. aureus con particolari caratteristiche fonotipiche è il principale batterio patogeno che porta alla mastite cronica. Nel presente studio, anche se S. aureus SCV22 e S. aureus11 avevano diverse caratteristiche fenotipiche e curve di crescita, i loro frammenti mirati erano gli stessi mediante amplificazione multipla PCR.
Da quando il fenomeno SCVs è stato trovato dai ceppi di Eberthella typhosa da Jacobsen nel 1910, sono stati riportati vari SCVs da diversi batteri. Tra questi, S. aureus SCVs sono stati selvaggiamente studiati, le loro caratteristiche principali sono piccole colonie, crescita lenta, formando biofilm, sopravvivendo nelle cellule ospiti cronicamente, e anche riducendo la sensibilità agli antibiotici, che sono coerenti con i nostri risultati, di cui fenotipo piccolo e crescita lenta di SCVs sono principalmente causati da difetti metabolici, e due tipi possono essere divisi, tra cui difetto di trasferimento di elettroni e difetto di sintesi della timina. Il primo è il tipico auxotrofo; il fenotipo normale può essere formato fornendo menadione o emina. In questo studio, il risultato ha mostrato che S. aureus SCV22 era S. aureus SCV dipendente dalla timina; questo tipo era stato riportato da pazienti con fibrosi cistica (CF) in precedenza.
Nel presente studio, S. aureus SCV22 aveva un’alta resistenza a SXT, mentre i loro ceppi parentali erano sensibili. SXT può interferire con la sintesi dell’acido tetraidrofolico per inibire la crescita di S. aureus. Per resistere a SXT, gli SCV timina-dipendenti hanno assorbito la timina in extracellulare e sono sopravvissuti alla fine. Questo fenomeno degli SCV timina-dipendenti può essere legato alla mutazione per interruzione del gene thyA, perché la timidilica sintetasi dell’acido e l’acido tetraidrofolico codificati dal gene sono coenzima importante per la timidilica sintetasi dell’acido.
In questo studio, i risultati del saggio intracellulare, del test di apoptosi e della microscopia elettronica a scansione hanno indicato che gli SCV di S. aureus hanno persistito più a lungo nei fagociti non professionali senza danni profondi, come precedentemente riportato. Questa caratteristica ha evitato con successo l’immunità dell’ospite e la terapia antibiotica che spiegava in parte la sua resistenza agli antibiotici e il fallimento della risposta immunitaria anticorpo-mediata (AMIR).
In conclusione, la mastite cronica è diffusa negli allevamenti di mucche nello Yunnan probabilmente a causa della libera circolazione, della tecnologia di produzione obsoleta, della mancanza di personale tecnico e dell’abuso di antibiotici. Nello studio, gli SCV di S. aureus isolati dalle mucche da latte sono stati riportati per la prima volta nello Yunnan, che sono fortemente collegati alla mastite cronica. Ad oggi, non esiste un trattamento per eliminare completamente la mastite cronica nella produzione; quindi, ulteriori studi dovrebbero essere condotti per conoscere meglio i meccanismi di infezione di S. aureus SCVs nella mastite cronica.
Conflitto di interessi
Non c’è conflitto di interessi.
Riconoscimento
Questa ricerca è stata supportata dal progetto della Chinese National Natural Science Foundation (31260629).