Hypertrofie van Ligamentum Flavum in lumbale wervelkolomstenose is geassocieerd met een verhoogd miR-155 niveau

Abstract

Hypertrofie van ligamentum flavum (LF) draagt bij tot lumbale wervelkolomstenose (LSS) en wordt voornamelijk veroorzaakt door fibrose. Recente gegevens tonen aan dat miR-155 een cruciale rol speelt in de pathogenese van verschillende fibrotische aandoeningen. Deze studie had tot doel de hypothese te testen dat miR-155 de dikte van het LF beïnvloedt door de collageenexpressie te reguleren. We vonden dat de dikte van het LF en de expressie van collageen I en, collageen III hoger waren in LF van LSS patiënten dan in LF van lumbale discus herniatie (LDH) patiënten (). De expressie van miR-155 was significant hoger in LF van LSS groep dan in LF van LDH groep (). miR-155 niveau was positief gecorreleerd met LF dikte (, ), type I collageen niveau (, ), en type III collageen niveau (, ). miR-155 mimic verhoogde mRNA en proteïne expressie van collageen I en collageen III in fibroblasten geïsoleerd uit LF, terwijl miR-155 spons het mRNA en proteïne expressie van collageen I en III in fibroblasten verminderde. Conclusies: miR-155 is een fibrose-geassocieerd miRNA en kan een belangrijke rol spelen in de pathogenese van LF hypertrofie.

1. Inleiding

Lumbale spinale stenose (LSS) is een veel voorkomende aandoening bij oudere patiënten. LSS wordt gedefinieerd als een vernauwing van het wervelkanaal met beknelling van het ruggenmerg of de zenuwwortel, resulterend in de symptomen van radiculopathie of pseudoclaudicatie. Hypertrofie van het ligamentum flavum (LF) is meestal betrokken bij de pathogenese van LSS, waardoor de diameter van het wervelkanaal kan worden verkleind en de durale zak en de zenuwwortels kunnen worden samengedrukt, met symptomen als gevolg, zelfs in afwezigheid van een uitpuilende annulus fibrosus of hernia nucleus pulposus of osseuze uitlopers.

LF is een goed gedefinieerde elastische structuur die bestaat uit elastische (80%) en collageen (20%) vezels. Hypertrofische LF weefsels worden gedesorganiseerd en vertonen verminderde niveaus en degeneratie van elastische vezels maar verhoogde niveaus van collageenvezels . Tijdens LF hypertrofie zijn er toenames in de expressie en activiteit van verschillende moleculen, waaronder matrix metalloproteasen (MMPs) , weefselremmers van matrix metalloproteasen (TIMPs) , plaatjes-afgeleide groeifactor-BB (PDGF-BB) , bindweefsel groeifactor (CTGF) , bot morfogenetisch eiwit (BMP) , en inflammatoire cytokines .

microRNAs (miRNAs) zijn evolutionair geconserveerde, enkelstrengs niet-coderende RNA moleculen van 19-24 nucleotiden die genexpressie controleren op posttranscriptioneel niveau. miRNA expressie handtekeningen zijn in verband gebracht met klinisch-pathologische kenmerken en de uitkomsten van verschillende ziekten . Er is echter zeer weinig geweten over de rol van miRNAs in LF hypertrofie. miRNAs spelen een cruciale rol in weefselafbraak en fibrose. miRNAs zouden de afbraak van kraakbeen kunnen bevorderen door de expressie te reguleren van genen die coderen voor katabole factoren zoals MMP en ADAMTS . In het bijzonder werd een significante toename van de expressie van miR-155 waargenomen in fibroblast cellen en weefsels van reumatoïde artritis patiënten. MiR-155 is een typisch multifunctioneel miRNA dat een cruciale rol speelt in verschillende fysiologische en pathologische processen, zoals hematopoietische lijndifferentiatie, immuniteit, kanker, cardiovasculaire aandoeningen, en ontstekingsreacties.

In deze studie wilden we de potentiële rol van miR-155 in de ontwikkeling van LF hypertrofie bij patiënten met LSS onderzoeken. We vergeleken de dikte, elastine degradatie, fibrose, collageen I en collageen III expressie, en miR-155 expressie in LF van patiënten met LSS met die van patiënten met een lumbale discus herniatie (LDH). Vervolgens onderzochten we de correlatie tussen miR-155 niveau en LF kenmerken. Tenslotte onderzochten we de effecten van miR-155 op de expressie van type I en III collageen in gekweekte menselijke LF cellen.

2. Methoden

2.1. Monsters

LF monsters werden verkregen van 15 patiënten (7 mannen, 8 vrouwen, gemiddelde leeftijd: 65,67 jaar, range: 63-71 jaar) die een decompressieve laminectomie ondergingen als gevolg van symptomatische degeneratieve lumber spinale stenose. Als controle werden LF stalen genomen bij 15 patiënten (10 mannen, 5 vrouwen, gemiddelde leeftijd: 25,17 jaar, spreiding: 20-30 jaar) met lumbale discusherniatie die operatief behandeld werden voor deze aandoening. De LF werden genomen uit L4/5 en vervolgens onderworpen aan histologische kleuring, Masson’s trichrome kleuring, immunohistochemische analyse, en biologische evaluatie. De studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische toetsingscommissie met schriftelijke geïnformeerde toestemming van elke patiënt.

2.2.

Magnetic resonance imaging (MRI) werd uitgevoerd om de dikte van het LF te meten bij elk van de 30 patiënten. Op het axiale T1-gewogen beeld door het facetgewricht, werd het LF duidelijk waargenomen als een massa met lage signaalintensiteit net aan de ventrale zijde van het facetgewricht. De maximale dikte van het LF werd getraceerd met behulp van de handmatige cursortechniek door een ervaren chirurg en automatisch gemeten in het PACS-systeem. De meting van elk ligament werd driemaal herhaald, en de gemiddelde waarde werd gebruikt als de uiteindelijke dikte van het LF.

2.3. Histologische analyse

De specimens werden sagittally gesneden, gefixeerd in 10% formaline gedurende 48 h, en ingebed in een paraffine blok. Er werden dunne coupes (4 μm) gemaakt en gekleurd door hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en Masson’s trichrome kleuring door een ervaren patholoog die de herkomst van de specimens niet kende. H&E-kleuring bracht de morfologie en structuur van het LF en de graad van elastineafbraak aan het licht. Masson’s trichrome kleuring werd gebruikt om de elastische vezel (roze) en de collagene vezel (blauw) te identificeren en de graad van fibrose te bepalen

2.4.

Totaal RNA werd geïsoleerd uit monsters of cellen met TRIZOL (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Om type I en III collageen mRNA expressieniveaus te meten, werd cDNA omgekeerd getranscribeerd van geïsoleerd RNA door incubatie van 500 ng DNase behandeld RNA met een first-strand synthese kit (Advanced Biotechnologies). Real-time PCR werd uitgevoerd met SYBR groene kleurstof in een thermische cycler met de volgende parameters: 40 cycli, 94°C gedurende 30 seconden, 60°C gedurende 20 seconden, en 72°C gedurende 15 seconden. Om het niveau van miR-155 te meten, werd RT-PCR uitgevoerd met de All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit (Tiangen). De volgende primers werden gebruikt: collageen I forward: 5′-GTGCGATGACGTGATCTGTGA-3′, reverse: 5′-CGGTGGTTTCTTGGTCGGT-3′; collageen III forward: 5′-GCCAAATATGTGTCTGTGACTCA-3′ en reverse: 5′-GGGCGAGTAGGAGCAGTTG-3′; miR-155 forward TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT. Alle primers werden gesynthetiseerd door Shenggong Inc. Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van de vergelijkende ΔΔCT-methode om het verschil te berekenen tussen de drempelcyclus (CT)-waarden van de doel- en referentiegenen in elk monster.

2.5. Western Blot Analyse

Weefselmonsters en gekweekte cellen werden gelyseerd in RIPA-buffer met proteaseremmerscocktail. Gelijkwaardige hoeveelheden eiwit werden gescheiden door elektroforese en overgebracht op een Immobilon-P Transfer Membraan (Millipore). De membranen werden geblokkeerd met 5% vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing en vervolgens geïncubeerd met Col 1 of Col 3 monoklonale antilichamen (Abcam, USA), gevolgd door incubatie met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (Abcam, USA). Actine (Abcam, USA) werd gebruikt als een loading control.

2.6. Primaire cultuur van LF Fibroblast Cellen

De LF monsters werden aseptisch verkregen van zes jonge patiënten die een spinale operatie ondergingen. De ontleedde specimens werden in kleine stukjes gehakt en gedigesteerd in serumvrij medium (Gibco) met 250 U/mL type I collagenase (Sigma) bij 37°C in een atmosfeer met 5% CO2. De verteerde monsters werden gewassen met serumbevattend medium om de collagenase-activiteit te remmen en vervolgens in 35 mm schaaltjes in Dulbecco’s Modified Eagle Medium en Ham’s F-12 medium (DMEM/F12, Gibco), aangevuld met 10% warmtegeïnactiveerd foetaal runderserum (FBS, Gibco-BRL) geplaatst. De culturen werden geïncubeerd bij 37°C in een gehumidificeerde atmosfeer met 5% CO2. Het medium werd om de twee dagen ververst. Na twee weken begonnen de cellen uit de ligamentchips te migreren en vormden zij een monolaag. De cellen werden gedurende twee tot drie weken in DMEM/F12 met 10% FBS, 1% v/v penicilline en streptomycine (Sigma) gehouden in een incubator met een gehumidificeerde atmosfeer van 5% CO2. De eiwitexpressie niveaus van type I en III collageen werden gedetecteerd door immunocytochemie zoals eerder beschreven

2.7. Vector Constructie

hsa-miR-155 precursorsequentie werd verkregen van miRBase (http://www.mirbase.org/): CTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTTTGCCTCCAACTGACTCCTACATATTAGCATTAACAG. hsa-miR-155-sequentie was UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU, en de complementaire DNA-sequentie was ACCCCTATCACAATTAGCATTAA. De miR-155 sponzen werden ontworpen als drie onvolledige complementaire sequenties. De oligo’s werden gekloond in pCDH-GFP om pCDH-miR-155 of pCDH-miR-155-sponge plasmide te maken.

2.8. Lentivirus verpakking en infectie

Voor transfectie, werden 293T cellen gekweekt bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator tot de cellen 70-80% confluentie bereikt, en de monolaag cellen werden getransfecteerd met PCDH-GFP, pCDH-miR-155, of pCDH-miR-155-spons plasmide gemengd met psPAX2 en pMD met behulp van liposomen. Het kweekmedium werd weggegooid na 4 uur, en de cellen werden 3 keer gewassen met PBS. Tenslotte werd 15 ml celkweekmedium met 10% foetaal runderserum toegevoegd en de cellen werden gekweekt gedurende 24 uur. Vervolgens werden de supernatanten met GFP (blanco groep), miR-155 (OE groep), of miR-155 spons (Sponge groep) lentivirussen verzameld en gebruikt om fibroblast cellen te infecteren. Een ander lentivirus dat een onzin miRNA bevatte werd gebruikt als controle (CON-groep).

2.9. Statistische analyse

De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD en geanalyseerd met behulp van SPSS versie 12 statistische analysepakket (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). De metingen van LF dikte werden vergeleken met behulp van student’s t-test. Verschillen in collageen I, collageen III, mRNA, en proteïne expressie niveaus en miR-155 niveau tussen de groepen werden geëvalueerd door een-weg ANOVA. De correlaties tussen LF dikte, collageen I, collageen III, en miR-155 niveaus werden geanalyseerd met Spearman methode. werd beschouwd als statistisch significant.

3. Resultaten

3.1. Dikte van het LF

De dikte van het middengedeelte van het LF werd gemeten. De gemiddelde dikte van het LF was 2,8 ± 0,7 mm (bereik: 1,63-3,87 mm) in de LDH-groep en 5,3 ± 1,0 mm (bereik: 3,95-7,48 mm) in de LSS-groep. Dit verschil was significant ().

3.2. Elastine Degradatie en Fibrose van LF

Histologische analyse toonde aan dat de elastische vezel gebied afgenomen en collageen gebied toegenomen in LF van LSS groep, in vergelijking met LDH groep. In LDH groep, werden rijke elastische vezels gerangschikt in parallelle volgorde (figuur 1 (a) en 1 (b)). Echter, in LSS groep, de elastische vezels waren gefragmenteerd, ongeorganiseerd, en focaal verloren, vergezeld van de proliferatie van collageen vezels (Figuren 1 (c) en 1 (d)). Masson’s trichroom kleuring toonde aan dat, in LF van LDH groep, een groot gebied was roze gekleurd en vertoonde een regelmatige regeling, met vermelding van een normale niet-fibrotische toestand (figuren 1 (e) en 1 (f)), maar in LF, van LSS groep, een groot gebied was blauw gekleurd, met vermelding van de aanwezigheid van massale fibrose (figuren 1 (g) en 1 (h)).

(a)

(a)

(b)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

3.3. Collagenen I en III Expressie in LF

De mRNA expressieniveaus van zowel collagenen I als III waren significant verhoogd in LF monsters van de LSS groep (Figuur 2(a)). De expressie van collagenen I en III eiwit is hoger in LF monsters van LSS groep dan van LDH groep (Figuur 2 (b) en 2 (c)).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figuur 2

De expressie van collageen I en collageen III in LF specimens van LSS en LDH patiënten. (a) Real-time PCR-analyse toonde aan dat de relatieve mRNA-niveaus van collageen I en collageen III in LF significant hoger waren in de LSS-groep dan in de LDH-groep. (b) Western blot analyse van collageen I en collageen III expressie in LF van LSS en LDH groepen. (c) De relatieve eiwitniveaus van collageen I en collageen III in LF waren significant hoger in LSS groep dan in LDH groep.

3.4. miR-155 Level in LF

Het gemiddelde niveau van miR-155 was 1.1748 ± 0,047 (range: 1,1278-1,2218) in de LDH groep en 5,1081 ± 0,703 (range: 4,4051-5,8111) in de LSS groep. miR-155 niveau was significant hoger in LF monsters van de LSS groep dan in die van de LDH groep (, Figuur 3(a)). Correlatie analyse toonde aan dat miR-155 niveau steeg parallel met de dikte van het LF, met een positieve en significante correlatie. De regressie coëfficiënt was 0,958 (figuur 3 (b)). Bovendien vertoonde de expressie van collageen type I en III een positieve en significante correlatie met miR-155 niveau in het LF (figuur 3(c)). De regressie coëfficiënten waren 0,827 () en 0,825 () voor types I en III collageen, respectievelijk.

(a)

(b)

(b)

(c)

(c)

(a)
(b)
(c)

3.5. miR-155 Upreguleert Collagens I en III Expressie in LF Fibroblasten

Om de rol van miR-155 in de regulatie van type I en III collageenexpressie in LF te bepalen, isoleerden we fibroblasten van LF en infecteerden hen met lentivirussen. RT-PCR analyse toonde aan dat de mRNA expressie van type I en III collageen verhoogd was in cellen geïnfecteerd met miR-155 mimic lentivirus vergeleken met controles (Figuur 4(a)). Western blot analyse toonde aan dat de eiwitexpressie van type I en III collageen verhoogd was in cellen geïnfecteerd met miR-155 mimic lentivirus vergeleken met controles (Figuren 4(b) en 4(c)). Immunocytochemie bevestigde dat de kleuring van type I en III collageen duidelijk sterker was in cellen geïnfecteerd met miR-155 mimic lentivirus in vergelijking met de controles (Figuren 4 (d) – 4 (g)).

(a)

(a)

(b)

(b)

(c)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

In tegenstelling, was mRNA expressie van type I en III collageen verlaagd in cellen geïnfecteerd met miR-155 sponge lentivirus in vergelijking met controles (Figuur 5(a)). Dienovereenkomstig toonde Western blot analyse aan dat de eiwitexpressie van type I en III collageen was afgenomen in cellen geïnfecteerd met miR-155 sponge lentivirus in vergelijking met controles (Figuren 5(b) en 5(c)). Immunocytochemie bevestigde dat de kleuring van type I en III collageen zwakker was in cellen geïnfecteerd met miR-155 spons lentivirus in vergelijking met de controles (Figuren 5 (d) – 5 (g)).

(a)

(a)

(b)

(b)

(c)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

4. Discussie

LF bevat een hoge concentratie elastine, waardoor de contractie tijdens flexie en de rek tijdens extensie . Het is bekend dat LF hypertrofie LSS kan veroorzaken, wat kan leiden tot lage rugpijn. In deze studie stelden we vast dat de gemiddelde dikte van LF in de LSS groep significant groter was dan die in de LDH groep. We zagen ook onregelmatig gerangschikte, gescheurde, gezwollen en verminderde elastische vezels, hyalinisatie en een verhoogd aantal collageenvezels in LF van LSS groep. Bovendien stelden we vast dat LF van de LSS groep een hoge fibrosescore vertoonde. Deze resultaten zijn consistent met eerdere studies die een toename van het collageengehalte (fibrose) en een verminderde elastine-collageen ratio in hypertrofisch LF aantoonden.

Voor zover wij weten, is dit het eerste rapport dat de relatie tussen LF hypertrofie en miRNA expressie beschrijft. Recente studies hebben een belangrijke rol van miR-155 in de pathogenese van osteoartritis en fibrotische ziekten aangetoond. Hier hebben we ons gericht op de rol van miR-155 in de pathogenese van LF hypertrofie. We ontdekten dat miR-155 significant upgereguleerd was in LF weefsel van LSS patiënten in vergelijking met LDH patiënten. Correlatie analyse toonde aan dat verhoogde miR-155 expressie gecorreleerd was met de dikte, fibrotische score, en de expressie van type I en III collageen in LF. Verder isoleerden we fibroblasten van LF en toonden aan dat miR-155 de expressie van type I en type III collageen in deze cellen upreguleerde.

Chronische ontsteking is een belangrijke risicofactor voor LF hypertrofie. De progressie van LF hypertrofie gaat gepaard met een hoge mate van macrofaag infiltratie. Bovendien werden macrofagen geïdentificeerd als een belangrijke cellulaire bron van inflammatoire cytokines in LF hypertrofie . Recent werd miR-155 geïdentificeerd als een component van de primaire macrofaag respons op inflammatoire mediatoren. Bovendien hebben verschillende studies aangetoond dat transformerende groeifactor- (TGF-) betrokken is bij het proces van hypertrofische veranderingen tijdens LF . Interessant is dat miR-155 een direct doelwit is van de TGF-/Smad pathway, die miR-155 expressie induceert via Smad4. miR-155 draagt bij tot de regulatie van de TGF-/Smad pathway door rechtstreeks SMAD2 en SMAD5 te targeten. Deze bevindingen leggen een sterk verband tussen miR-155, TGF- pathway, en LF hypertrofie en geven aan dat miR-155 een kritieke factor is die fibroblast fibrose en LF hypertrofie regelt.

Er zijn verschillende beperkingen aan onze huidige studie. Ten eerste, onze steekproefgrootte werd beperkt door de ethische toetsingscommissie. Ten tweede konden we geen normaal LF verzamelen en in plaats daarvan gebruikten we controlemonsters van patiënten met discusherniaties, van wie de gemiddelde leeftijd aanzienlijk jonger was dan die van de patiënten met spinale stenose. Daarom kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat de veroudering een invloed kan hebben op de expressie van miR-155. Het zou ideaal geweest zijn om twee verschillende controles te hebben: leeftijd en geslacht gematchte specimens van patiënten zonder stenose en geslacht gematchte specimens van late-tieners. De eerste zou leeftijd als onafhankelijke variabele elimineren, aangezien niet alle oude patiënten spinale stenose ontwikkelen. Het is mogelijk dat, net als bij atherosclerose, een genetische predispositie de biochemische factoren verandert die bijdragen tot de pathologische aandoening. Monsters van late-tieners die geen degeneratieve veranderingen hebben, zouden ons in staat stellen de omvang van de verstoringen die bij spinale stenose optreden, te bepalen. Jammer genoeg ondergaan deze twee ideale controles zelden een chirurgische behandeling, waardoor het bijna onmogelijk is om tijdig voldoende stalen te verzamelen. Zo zijn we uiteindelijk uitgekomen op onze huidige controles. Hoewel zij niet ideaal zijn, zijn zij redelijk en geschikt om de hypothese te testen die wij in deze studie hebben gesteld. In de literatuur over ligamentum flavum hypertrofie, werd de jonge discus herniatie groep vaak gebruikt als controlegroep

5. Conclusies

Samenvattend vonden we dat miR-155 werd geupreguleerd in patiënten met lumbaal ligamentum flavum hypertrofie. Het expressieniveau van miR-155 was gecorreleerd met de dikte en de graad van fibrose van LF. miR-155 verhoogde de expressie van type I en III collageen in fibroblasten van LF. Deze gegevens suggereren dat miR-155 een fibrose-geassocieerd miRNA is en een belangrijke rol kan spelen in de pathogenese van LF hypertrofie.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Authors’ Contribution

Jianwei Chen en Zhanchun Li ontwierpen de studie en schreven het artikel. Jianwei Chen, Guibin Zhong, Lie Qian, Zhanchun Li, Zhiguang Qiao, Bin Chen, en Hantao Wang voerden de experimenten uit en analyseerden de gegevens. Alle auteurs lazen en keurden het uiteindelijke paper goed.

Acknowledgments

De auteurs zijn Dr. Zhiguang Qiao dankbaar voor zijn voorbereidende werk voor deze studie en danken het Biomedical Research Center in Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, voor het gebruik van instrumenten. De studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation van China (81370976) en Shanghai Natural Science Foundation, China (13zr1424900).