Geny homeobox w embriogenezie i patogenezie

Greckie słowo „homeo” oznacza podobny, a geny homeotyczne (lub HOM) Drosophila są tak nazwane ze względu na ich zdolność, gdy są zmutowane, do przekształcania jednego segmentu ciała owada na podobieństwo innego. Na przykład, mutacje utraty funkcji genu Ultrabithorax (Ubx) prowadzą do transformacji trzeciego segmentu piersiowego niosącego haltery (małe balansery, patrz Ryc. 1) w kierunku drugiego segmentu piersiowego ze skrzydłami, generując w ten sposób czteroskrzydłe muchówki (omówione wRef. 1 i 4). Pionierska praca E. B. Lewisa(5) wykazała, że normalną funkcją genów homeotycznych jest przypisanie odrębnej tożsamości przestrzennej (lub pozycyjnej) komórkom w różnych regionach wzdłuż osi przednio-tylnej muchy, i że to kombinacja genów homeotycznych (lub kod homeotyczny) wyrażonych w danej komórce „mówi” jej, że należy do głowy, tułowia lub odwłoka muchy.

Geny Hox ssaków zostały zdefiniowane na podstawie ich homologii z genami kompleksu homeotycznego (HOM-C) Drosophila. Analiza mysich i ludzkich genów Hox wskazuje, że jest ich co najmniej 39, zorganizowanych w cztery klastry, HoxA, HoxB, HoxC i HoxD, z których każdy zlokalizowany jest na innym chromosomie (np. ludzkie chromosomy 7, 17, 12 i 2, odpowiednio) i obejmuje 9-11 genów (ryc. 1). Na podstawie podobieństw sekwencji i względnej pozycji w kompleksie, poszczególne geny Hox w obrębie różnych klastrów mogą być dopasowane do siebie i do genów klastra HOM-C Drosophila. Podobieństwa te sugerują, że cztery klastry ssaków powstały prawdopodobnie z jednego kompleksu przodków, poprzedzającego dywergencję między stawonogami i chrzęstniakami 600 milionów lat temu, po pierwsze poprzez ekspansję klastra w wyniku bocznej duplikacji genów (spowodowanej na przykład nierównomiernym krzyżowaniem podczas mejozy), a po drugie, podczas przejścia od głowonogów do kręgowców, poprzez duplikację klastrów w wyniku duplikacji chromosomalnej lub poliploidyzacji.

W zarodkach ssaków, najwcześniejsza ekspresja genów Hox może być wykryta w gastrulacji. Geny Hox ulegają ekspresji we wszystkich trzech warstwach zarodkowych z zachodzącymi na siebie domenami, które rozciągają się od ogonowego końca zarodka do ostrej przedniej granicy, która jest specyficzna dla każdego genu Hox. Geny Hox ułożone są w tej samej kolejności wzdłuż chromosomów, w jakiej ulegają ekspresji wzdłuż osi anteroposteriorycznej zarodka, tzn. geny, które znajdują się 5′ w klastrach, ulegają ekspresji najbardziej z tyłu, podczas gdy geny położone bardziej 3′ ulegają stopniowej ekspresji w regionach bardziej przednich. Co istotne, ta korelacja, zwana „przestrzenną współliniowością”, zachodzi również w przypadku genów homeotycznych Drosophila (patrzRef. 6) (Ryc. 1).

Geny Hox w kształtowaniu szkieletu osiowego. Wobec braku oczywistych, naturalnie występujących mutacji w kręgowych genach Hox, dopiero rozwój myszy transgenicznych i technologii celowania genów pozwolił na wygenerowanie zarówno mutacji typu gain-of-function jak i loss-of-function w linii zarodkowej myszy(7, 8).

W Drosophila, ektopowa ekspresja genu homeotycznego często skutkuje tylnymi transformacjami homeotycznymi. Na przykład, mutacje gain-of-function Ubx (ryc. 1) prowadzą do przekształcenia drugiego w trzeci segment piersiowy z przekształceniem skrzydeł w drugą parę półtoraków. Podobnie, ektopowa ekspresja genu Antennapedia (Antp), będąca wynikiem spontanicznej inwersji chromosomalnej, umieszczająca region kodujący białko tego genu pod kontrolą heterologicznego promotora, prowadzi do przekształcenia anteny w mezotorakalne (drugie piersiowe) odnóża (przegląd wRef. 1). Pierwszych dowodów na ewolucyjne zachowanie funkcjonalnych genów Hox u ssaków dostarczyły dwa eksperymenty typu gain-of-function przeprowadzone przez M. Kessel i wsp.(9) w Instytucie Maxa Plancka w Getyndze oraz przez T. Lufkin i wsp.(10) w naszej grupie. Skonstruowaliśmy transgen, w którym sekwencja kodująca Hoxd-4 została połączona z regionem promotorowym genu Hoxa-1. Konstrukt ten został następnie zintegrowany z genomem myszy. U dzikich zarodków myszy Hoxd-4 ulega ekspresji do poziomu piątego somitu, który bierze udział w tworzeniu atlasu (C1 na ryc. 2D). Umieszczenie Hoxd-4 pod kontrolą elementów cis-regulacyjnych Hoxa-1 prowadzi jego ekspresję do ektopowej domeny przedniej, która obejmuje cztery somity potyliczne, które normalnie łączą się, tworząc kości podstawne i potyliczne (B i E na ryc. 2D). U noworodków transgenicznych z „promotorem Hoxa-1 – Hoxd-4″(Hoxd-4+), kości potyliczne są zastąpione przez jedną do czterech ektopowych skostniałych struktur (A1-A4) przypominających łuki neuralne kręgów, a kość podstawna, normalnie płaska, nabiera cylindrycznego kształtu przypominającego trzon kręgu (B* na Rys. 2E)(10). Tak więc ektopowa ekspresja Hoxd-4 prowadzi do tylnych przekształceń homeotycznych, podobnie jak mutacje gain-of-function genów homeotycznych u Drosophila. Eksperyment ten dostarczył również dowodów na to, że przynajmniej część sieci genów HOM/Hox została wykorzystana do nadania morfologicznej tożsamości segmentowanym strukturom w grupach zwierząt stosujących radykalnie różne strategie rozwojowe, oraz że pewien aspekt funkcji genów został zachowany od czasu rozejścia się stawonogów i strunowców. Ta filogenetyczna konserwacja funkcji jest wzmocniona przez możliwość ratowania mutacji utraty funkcji w genie homeotycznym Drosophila za pomocą genów Hox. Warto również zauważyć, że wady rozwojowe obserwowane u myszy ektopowo wyrażających Hoxd-4 odpowiadają normalnym cechom agnatów, najbardziej prymitywnych kręgowców, które miały kręgi potyliczne zamiast kości potylicznych. To, że zmiana ekspresji pojedynczego genu Hox jest wystarczająca do wywołania zmiany atawistycznej może pomóc w zrozumieniu wydarzeń genetycznych, które odegrały kluczową rolę w ewolucji kształtu dzisiejszych kręgowców z bardziej prymitywnych (przegląd wRef. 12).

Do tej pory odnotowano również liczne mutacje typu loss-of-function w genach Hox u ssaków (przegląd wRef. 13). Strategia ta polega na celowym zaburzeniu funkcjonowania genów poprzez rekombinację homologiczną. W skrócie, allel typu dzikiego jest zastępowany niefunkcjonalnym allelem w genomie komórki ES, która jest następnie wstrzykiwana do blastocysty myszy w celu wygenerowania chimery, z której wywodzą się zmutowane zwierzęta poprzez germinalne przekazanie mutacji. W ciągu ostatnich kilku lat ponad połowa genów Hox została funkcjonalnie inaktywowana. W większości tych badań fenotyp mutanta null obejmował co najmniej jedną transformację kręgów, jak na przykład: „potylicyzacja” atlasu (np. inaktywacja Hoxd-3; ryc. 2F)(14); transformacja osi do tożsamości atlasowej, o której świadczy powstanie łuku brzusznego na poziomie drugiego kręgu szyjnego (np. inaktywacja Hoxb-4)(15); przekształcenie pierwszego kręgu lędźwiowego w kręg piersiowy, wytwarzając w ten sposób supernumerarną 14. parę żeber (np. inaktywacja Hoxc-8)(16); przekształcenie pierwszego kręgu krzyżowego w kręg lędźwiowy (np. inaktywacja Hoxd-11)(17), inaktywacja Hoxd-11)(17, 18). Warto zauważyć, że transformacje osiowe prawie zawsze odpowiadają anteriorizacji, tak że przekształcony kręg(e) uzyskuje morfologię swojego przedniego sąsiada typu dzikiego. Podobnie, mutacje typu loss-of-function genów homeotycznych u muszki owocowej prowadzą do homeotycznych transformacji segmentów ciała w kierunku przedniego przeznaczenia (patrz wyżej). Co więcej, myszy zmutowane null dla danego genu Hox zwykle wykazują transformacje homeotyczne w najbardziej wysuniętym do przodu regionie, w którym ten gen Hox ulega normalnej ekspresji, a nie w regionach, w których ekspresji ulega bardziej 5′ gen.

W sumie, wyniki mutacji typu gain- i loss-of-function wspierają koncepcję hierarchii funkcji genów homeotycznych zarówno u myszy, jak i u muszek: ogólnie rzecz biorąc, bardziej tylne działające białka Hox i homeotyczne dominują pod względem funkcji nad bardziej przednimi działającymi białkami. Zjawisko to, które zostało określone jako „dominacja tylna” (lub „przewaga tylna”) u myszy i „tłumienie fenotypowe” u much, sugeruje, że program morfogenetyczny na danym poziomie osi głównej ciała jest dyktowany przez najbardziej tylne (tj. najbardziej 5′-lokowane) białka.e. najbardziej 5′-lokowany w klastrze) gen Hox lub homeotyczny gen wyrażony na tym poziomie osiowym (przegląd wRef. 6).

Ostatnia analiza podwójnych i potrójnych mutantów Hox doprowadziła do częściowej rewizji modelu „tylnej przewagi” funkcji genów Hox. Do modelu został włączony aspekt ilościowy(6), który uwzględnia możliwość, że tandemowa duplikacja i tetraploidyzacja genów Hox u ssaków mogła doprowadzić do częściowej redundancji funkcji(18-22): to, że inaktywacja pojedynczego genu Hox powoduje przekształcenia kręgów tylko w jego najbardziej przedniej domenie ekspresji może odzwierciedlać fakt, że jest on ilościowo przeważający w tym regionie; jednakże jednoczesne zaburzenie działania dwóch (lub więcej) innych białek Hox ulegających ekspresji na tym samym poziomie osiowym, ale występujących pojedynczo w mniejszej ilości, może prowadzić do tego samego fenotypu. Dlatego też specyfikacja kręgów jest prawdopodobnie osiągana dzięki funkcjonalnej współpracy „kombinacji” genów Hox ulegających ekspresji na danym poziomie osiowym (kombinatoryka Hox(23)), a nie dzięki funkcji pojedynczego genu.

Geny Hox w morfogenezie kończyn oraz patterningu układu rozrodczego i pokarmowego. Rodzina genów Hox ssaków zawiera 15 genów spokrewnionych z genem Drosophila, Abd-B (ryc. 1). Poza ich domenami ekspresji wzdłuż kręgosłupa przedkręgowego, większość z tych genów związanych z Abd-B ulega ekspresji w nakładających się domenach w rozwijających się kończynach przednich i tylnych, co wskazuje na ich rolę w specyfikacji wzoru palców(24). Rzeczywiście, eksperymenty nokautujące geny związane z Abd-B u myszy skutkowały zmniejszeniem rozmiaru, zmianami kształtu i/lub opóźnionym kostnieniem elementów szkieletu zarówno kończyny przedniej (np. Hoxd-9, Hoxd-9, Hoxd-11)(17, 21, 25, 26) jak i tylnej (np. Hoxa-10)(18). Wyniki te wskazują, że geny te kontrolują początkowo alokację i wzrost kondensacji prechondrogennych, a następnie sekwencję kostnienia modeli chrzęstnych (przegląd wRef. 13). Nigdy jednak nie zaobserwowano przemian homeotycznych. Na przykład, zaburzenie genu Hoxd-13, który ulega ekspresji w presumptive digit territory, skutkuje skróceniem większości kości śródręcza i śródstopia, skróceniem lub brakiem niektórych paliczków, jak również utworzeniem supernumerarnego wędzidełka w kończynie przedniej(27)(Ryc. 3, A i B). Ukierunkowane wyłączenie Hoxa-13 spowodowało fenotyp autopodalny, odmienny od fenotypu jego paralogu Hoxd-13, w tym brak pierwszego palca zarówno w przednich jak i tylnych kończynach oraz zmianę niektórych elementów nadgarstkowo-stopowych, co sugeruje, że te dwa geny nie są funkcjonalnie równoważne dla rozwoju autopodalnego(28).

Z drugiej strony, fenotypy złożonych mutantów Hox ujawniły również częściowo redundantne funkcje w patterningu kończyn, jak w przypadku specyfikacji kręgów (patrz wyżej), pomiędzy genami paralogicznymi(28, 29) i nieparalogicznymi(18). Na przykład, mutanty złożone Hoxa-13/Hoxd-13 wykazywały zmiany wzrostu i patterningu autopodiów znacznie poważniejsze niż te obserwowane u każdego pojedynczego mutanta (tj. prawie całkowity brak patterningu chondrogenicznego; Ryc. 3, A-C), co wskazuje, że produkty tych genów mogą się również częściowo kompensować(28).

Dawno temu opisano dwie ludzkie dziedziczne anomalie kończyn, spowodowane mutacjami w genach HOXD13 i HOXA13(30, 31). Ludzki synpolydactly jest zespołem semidominującym i wynika z insercji in-frame krótkich odcinków poli(alaninowych) w N-końcowym regionie HOXD13(30). Co ciekawe, fenotyp ludzkich kończyn jest bardziej nasilony (zarówno w stanie homozygotycznym, jak i heterozygotycznym) niż fenotyp zaburzeń genu Hoxd-13 u myszy(27) (Ryc. 3, A i B). Z drugiej strony, nieprawidłowości kończyn synpolydactly przypominają te obserwowane u mutantów złożonych Hoxa-13/Hoxd-13(28)(Ryc. 3C). Prawdopodobnym wyjaśnieniem molekularnym jest to, że zmutowane ludzkie białko jest nieaktywne transkrypcyjnie, zachowując wszystkie swoje właściwości wiązania DNA, a więc wykazuje właściwości dominująco ujemne. Poprzez zajęcie miejsca wiążącego może ono zakłócać funkcje innych homeoprotein normalnie zaangażowanych w morfogenezę cyfr, jak na przykład HOXA13, prowadząc do zmian bardziej poważnych niż te wynikające z samej inaktywacji Hoxd-13(28, 32). Ludzki zespół ręka-stopa-genitalia jest autosomalnym dominującym zespołem spowodowanym mutacją nonsensowną w homeodomenie HOXA13(31), która wpływa przede wszystkim na pierwszy palec u nogi (zarówno kciuk, jak i wielki palec), jak również na rozwój przewodu Müllera, moczowodów i cewki moczowej (powodując macicę dwujajową lub dwurożną, ektopowe otwory moczowodowe i hypospadias). Fakt, że heterozygoty dla mutacji null Hoxa-13 u myszy wykazują wady, które są najwyraźniej mniej poważne niż te, które są widoczne w zespole ręka-stopa-genital wspiera wcześniejszą sugestię, że mutacja HOXA-13 powoduje powstanie białka wywierającego dominujący efekt negatywny(31) (X. Warot, C. Fromental-Ramain, P. Chambon, i P. Dollé, obserwacje niepublikowane).

Kilka badań ujawniło role dla innych genów Hox związanych z Abd-B w rozwijającym się układzie moczowo-płciowym i końcowej części przewodu pokarmowego. Zarówno męskie jak i żeńskie mutanty null Hoxa-10 są hipopłodne. Zmutowane osobniki męskie wykazują wnętrostwo, spowodowane nieprawidłowym tworzeniem się kanału pachwinowego i brakiem skracania się gubernaculum(33, 34). Ponadto, wykazują one malformację nasieniowodów, która przypomina częściową homeotyczną transformację w najądrze(35). Częściowa homeoza nasieniowodów do morfologii przypominającej najądrza jest również obserwowana u mutantów null Hoxa-11(36). Co ciekawe, samice mutantów Hoxa-10 null wykazują przednią transformację na odpowiednim poziomie układu rozrodczego, ponieważ proksymalna część macicy przekształca się w strukturę przypominającą jajowód(35). Dane te wyraźnie wskazują na ważną funkcję niektórych genów Hox w definiowaniu regionalnych losów wzdłuż przednio-tylnej osi przewodów Wolffa i Müllera.

Najbardziej „tylne” geny u myszy, Hoxd-12 i Hoxd-13, również mają specyficzną funkcję w morfogenezie końcowej części przewodu pokarmowego. Rzeczywiście, mutanty null Hoxd-12 i Hoxd-13 wykazują dezorganizację warstw mięśni gładkich tworzących wewnętrzny zwieracz odbytu, co skutkuje wypadaniem odbytnicy u niektórych mutantów(37).

Geny Hox w patterningu tylnego móżdżku i rozwoju twarzoczaszki. Mózgowie tylne lub rhombencephalon, jest przejściowo podzielone wzdłuż jego osi przednio-tylnej na serię segmentów (siedem u myszy i człowieka) zwanych rhombomeres(38). Ta segmentalna organizacja tylnego móżdżku determinuje segmentalną migrację NCC z neurektodermy w celu zasiedlenia i ukształtowania łuków gardłowych. Analizy hybrydyzacji in situ ujawniły, że generalnie część kombinacji genów Hox ulegających ekspresji w danym rombomerze ulega również ekspresji w NCC migrujących z tego rombu, co sugeruje, że geny Hox mogą odgrywać kluczową rolę w kształtowaniu regionu rozgałęzień głowy (patrzRef. 39).

Aby potwierdzić tę hipotezę, my i inni funkcjonalnie inaktywowaliśmy gen Hoxa-2(40, 41). NCC pochodzące z dwóch pierwszych rombów i mezencefalii ogonowej normalnie zasiedlają pierwszy (lub szczękowo-żuchwowy) łuk, gdzie dają początek zębom, szczęce, kościom płaskim, tympanom, młoteczkom i siekaczom oraz chrząstce Meckela. NCC wywodzące się z czwartego rombu zwykle zasiedlają drugi łuk (lub gnykowy) i tworzą strzemiączka, kość stylistyczną i mniejszy róg kości gnykowej. Hoxa-2 jest najbardziej „przednim” genem Hox, ponieważ jest jedynym członkiem tej rodziny, który ulega ekspresji w drugim rombomerze. Jednakże na tym poziomie osi przednio-tylnej jego ekspresja jest ograniczona do neurektodermy; tak więc NCC pierwszego łuku gardłowego nie wykazuje ekspresji żadnego genu Hox. W przeciwieństwie do tego, Hoxa-2 ulega ekspresji w NCC drugiego łuku gardłowego. U płodów Hoxa-2 null szkielet NCC drugiego łuku gardłowego jest selektywnie pozbawiony (np. strzemiączka, ryc. 2, A-C). W miejscu elementów szkieletowych drugiego łuku gardłowego obecny jest ektopowy, ogonowy zestaw elementów szkieletowych pierwszego łuku, będący w większości przypadków lustrzanym odbiciem swojego ortotopowego odpowiednika. Ten ektopowy zestaw obejmuje: 1) w obrębie ucha środkowego, supernumerarną kość sieczną, młoteczek, ściętą chrząstkę Meckela i kość bębenkową (ryc. 2, A-C); 2) poza obszarem ucha środkowego, małą supernumerarną kość gnykową(40). Te dane z analizy szkieletowej, w połączeniu z danymi dotyczącymi ekspresji genów, wskazują, że zaburzenie genu Hoxa-2 powoduje homeotyczną transformację tożsamości drugiego do pierwszego łuku gardłowego. Taka transformacja ujawnia, że program morfogenetyczny NCC pochodzącego z dwóch pierwszych rombów odpowiada podstawowemu (lub domyślnemu) programowi patterningu szkieletowego (GPP), który jest wspólny dla mezenchymalnego NCC co najmniej pierwszego i drugiego łuku gardłowego i nie wymaga ekspresji genów Hox. U myszy typu dzikiego GPP jest redefiniowany przez Hoxa-2, który, podobnie jak geny homeotyczne Drosophila, działa jako gen selekcyjny, dając specyficzny dla drugiego łuku program morfogenetyczny. Co ciekawe, atawistyczna struktura szkieletowa odpowiadająca chrząstce górnej szczęki (lub pterygoquadrate) reptilian rozwija się z drugiego łuku u mutantów Hoxa-2 (Fig. 2C); tak więc w przypadku braku tego genu, drugi łuk NCC wydaje się wykonywać GPP, który odpowiada fazie terapsydalnej ewolucji ssaków(12, 40).

Dodatkowe badania inaktywacyjne również potwierdziły ważną rolę genów Hox w patteringu łuków tylnobocznych i gardłowych. Na przykład, ukierunkowana inaktywacja Hoxa-3 prowadzi do niedoczynności przytarczyc oraz hipoplazji grasicy i tarczycy(42). Co ciekawe, defekty te obserwowane są również w zespole Di George’a (który jednak nie jest spowodowany mutacją genu Hox). U mutantów Hoxa-1 null stwierdzono defekty rombów 4 i 5, nieprawidłowości nerwów czaszkowych i ucha wewnętrznego(44, 45), a u myszy z nokautem Hoxb-1 i Hoxb-2 obserwowano selektywne niedobory jąder ruchowych nerwu twarzowego(46-48). Cechy tych fenotypów, takie jak paraliż mięśni twarzy, przypominają cechy porażenia Bella i zespołów Moebiusa u ludzi.

Dodaj komentarz Anuluj pisanie odpowiedzi

Archiwa

Meta