Viroids: Definition and Features

Background

Wiroidy zostały odkryte przez dr Theodora Dienera podczas wysiłków zmierzających do zidentyfikowania przyczyny choroby wrzecionowatych bulw ziemniaka. Początkowo sądzono, że chorobę tę wywołuje wirus. Eksperymenty mające na celu zidentyfikowanie hipotetycznego domniemanego wirusa przyniosły nieoczekiwane rezultaty. Obserwacje ujawniły, że większość czynników zakaźnych obecnych w ekstraktach z chorych roślin nie sedymentowała w postaci osadu, gdy poddawano je działaniu siły odśrodkowej, która była wystarczająca do sedymentacji wszystkich znanych wirusów. Wirowanie w gradiencie gęstości i elektroforeza w żelu poliakrylamidowym potwierdziły, że czynnik zakaźny był cząsteczką niekonwencjonalną. Ta osobliwa cząsteczka była wrażliwa na traktowanie rybonukleazą (brak infekcyjności) i niewrażliwa na traktowanie deoksyrybonukleazą, fenolem, chloroformem, n-butanolem lub etanolem. W 1967 roku stało się jasne, że czynnikiem wywołującym wrzecionowatość ziemniaka nie był wirus, dlatego zaproponowano termin „wiroid” dla tego wolnego zakaźnego RNA.

Wiroidy są ograniczonymi do roślin pasożytami, które mogą prowadzić do warunków powodujących znaczne straty w uprawach. Wiroidy składają się z jednoniciowego, kolistego RNA o niskiej masie cząsteczkowej (246-496 nt), nie posiadają jednak białka ani otoczki błonowej, a biorąc pod uwagę ich złożoną strukturę drugorzędową mają niezwykłe właściwości, takie jak odporność na trawienie i denaturację przez rybonukleazy. Wiroidy nie kodują żadnych białek pełniących specyficzne funkcje, ich mechanizm zakażenia systemowego opiera się na sekwestracji mechanizmów syntezy kwasów nukleinowych komórki gospodarza i interakcji z czynnikami genetycznymi gospodarza oraz autonomicznej replikacji poprzez mechanizmy replikacji typu rolling circle (tempo replikacji może przekraczać tempo degradacji).

Półprodukty replikacji obejmują dsRNA i są przetwarzane w trzech podstawowych etapach: synteza długich łańcuchów (wiele jednostek) mediowana przez polimerazy RNA zależne od DNA gospodarza, które są następnie przetwarzane do monomerów i ostatecznie ligowane w jednostki koliste. Najbardziej intrygujące pytania dotyczące chorób powodowanych przez wiroidy to: 1) w jaki sposób replikują się one autonomicznie w roślinach żywicielskich (molekularne podstawy zasięgu wiroidów), unikając mechanizmów obronnych przed infekcją, 2) w jaki sposób wiroidy rozprzestrzeniają się systemicznie (jakie czynniki żywicielskie uczestniczą w poszczególnych etapach cyklu replikacyjnego i handlu) oraz 3) w jaki sposób wiroidy wywołują objawy chorobowe (jakie są cele determinant patogeniczności wiroidów) bez kodowania białek.

Schemat klasyfikacji

Analizy porównawcze struktur pierwotnych i wtórnych pozwoliły na klasyfikację wiroidów do dwóch rodzin; rodziny te wykazują znaczące różnice w strukturach wtórnych, szlakach replikacji i lokalizacji subkomórkowej

Rodzina Pospiviroidae (większość wiroidów) jest akronimem pochodzącym od wiroidu wrzecionowatości bulw ziemniaka, reprezentatywnego typu gatunkowego. Wiroidy należące do tej rodziny przyjmują quasi-rodową lub prętopodobną strukturę drugorzędową, z regionami dsRNA oddzielonymi niesparowanymi wewnętrznymi pętlami jednołańcuchowymi, w której można wyróżnić pięć domen strukturalnych (referencja). Central Conserved Region (CCR), który zawiera miejsca konserwowane wśród gatunków z tego samego rodzaju i odgrywa rolę w replikacji/przetwarzaniu wiroidów, domeny końcowe lewa i prawa (TL, TR) związane z powielaniem i przemieszczaniem wiroidów, domenę zmienną (V), która jest najbardziej zróżnicowana wśród gatunków wiroidów tego samego rodzaju, oraz domenę patogenności (P) zawierającą elementy strukturalne, które w znacznym stopniu przyczyniają się do regulacji ekspresji objawów

W obrębie tych domen istnieją trzy, które są konserwowane między gatunkami: 1) CCR, utworzony przez dwie przeciwstawne serie nukleotydów, które są flankowane przez powtarzające się sekwencje odwrotne (dolna i górna gałąź), 2) Terminal Conserved Region (TCR), znajdujący się na górnej gałęzi lewej domeny terminalnej, oraz 3) Terminal Conserved Hairpin (TCH), który również znajduje się na lewej domenie terminalnej. Sekwencja CCR oraz obecność lub brak TCR i TCH (oba regiony nie występują jednocześnie) posłużyły do pogrupowania gatunków wiroidów z tej rodziny w pięć rodzajów (rodzaj CCR służy do określenia rodzaju). Gatunki definiuje się przede wszystkim na podstawie ich struktury pierwotnej. Przyjęto arbitralny poziom 90% identyczności sekwencji, aby oddzielić gatunki od szczepów

Rodzina Avsunviroidae. Trzy konserwatywne motywy wymienione powyżej nie występują u czterech gatunków wiroidów należących do drugiej rodziny określanej jako Avsunviroidae, której nazwa pochodzi od rodzaju gatunku, ASBVd. Klasyfikacja tych gatunków oparta jest na składzie G+C i przewidywaniach struktury drugorzędowej, na morfologii rybozymu młotkowego (HHRz) oraz na podstawie nierozpuszczalności w LiCl. Gatunki te wykazują właściwość polegającą na tym, że nici obu biegunów mogą ulegać auto-rozszczepieniu przez rybozymy młotkowe, a ponadto dwa z nich (ASBVd, PLMVd) przyjmują rozgałęzione struktury drugorzędowe i elementy struktury trzeciorzędowej, które pomagają w stabilizacji struktury.

Klasyfikacja wiroidów do dwóch rodzin jest również ważnym potwierdzeniem z innego punktu widzenia, który jest związany z replikacją. Członkowie rodziny Pospiviroidae replikują i gromadzą się w jądrze i nukleolu w wyniku asymetrycznego mechanizmu „rolling-circle”, a enzymami gospodarza, które mogą być zaangażowane w replikację członków tej rodziny są enzymy posiadające aktywność nukleazową, a konkretnie członkowie rodziny RNase III, enzym inny niż jedyna ligaza scharakteryzowana u roślin, oraz polimeraza II zależna od RNA DNA ; podczas gdy członkowie rodziny Avsunviroidae replikują i gromadzą się w chloroplaście, a replikacja przebiega w symetrycznym mechanizmie rolling-circle z wykorzystaniem plastydowej polimerazy RNA typu NEP (nucleus-encoded plastid), działają jako samokatalizujące rybozymy wykonywane przez motywy młotkowe zawarte w niciach obu biegunów,

Baza danych Subviral RNA Database (http://subviral.med.uottawa.ca/cgi-bin/home.cgi ) zawiera aktualne informacje i posiada dostępną kompilację czterdziestu trzech kompletnych genomów wiroidów, z których zgłoszono 4700 sekwencji wariantowych. Rodzina Pospiviroidae jest reprezentowana przez dwadzieścia siedem gatunków, a rodzina Avsunviroidae przez cztery gatunki; kilka innych gatunków nie zostało sklasyfikowanych.

Funkcjonalna analiza genomu

Rozmiary genomu wiroidów wahają się między 246-491 nukleotydów, ale pomimo minimalnego genomu i braku zdolności kodowania, modulują one replikację i kierują swoim wewnątrzkomórkowym, międzykomórkowym i długodystansowym przemieszczaniem. Wiadomo również, że aktywują one mechanizmy obronne rośliny i że w większości przypadków te mechanizmy obronne są niewystarczające do uniknięcia ekspresji objawów. Cząsteczka RNA wiroidów ma wiele różnych powiązanych funkcji biologicznych skondensowanych w swojej krótkiej sekwencji i bez kodowania białek, genom wiroidów musi bezpośrednio wyrażać funkcje biologiczne. Poprzednie badania wykazały, że prawie każdy nukleotyd jest funkcjonalny i podlega naturalnej selekcji. Znaczący postęp w zrozumieniu relacji wiroid-gospodarz będzie wynikiem kompleksowego rozbioru funkcji motywów genomu wiroidów oraz zrozumienia, jak oddziałują one z poszczególnymi czynnikami komórkowymi.

3.1. Pospiviroidae: Konserwowane domeny, motywy sekwencji i szpilki do włosów

Jak już wcześniej wspomniano, gatunki typu Pospiviroidae przyjmują strukturę drugorzędową przypominającą pręt. Struktura drugorzędowa stała się oczywista po sekwencjonowaniu szczepu pośredniego PSTVd (PSTVd-DI), dzięki przewidywaniom termodynamicznym i mikroskopii elektronowej. Później ta prętopodobna struktura została zaproponowana dla większości gatunków Pospiviroidae. Obecność pięciu domen strukturalnych ujawniono wykonując porównawczą analizę sekwencji.

R, TL.- Domeny te są wymienne pomiędzy wiroidami i mogą odgrywać rolę w rearanżacji RNA podczas ewolucji wiroidów. Domeny te są również zaangażowane w przemieszczanie się wiroidów w roślinach ; .

TL.- Lewy końcowy koniec większości gatunków Pospiviroid i Apscaviroid zawiera niedoskonałe powtórzenie; w PSTVd odpowiednie sekwencje znajdują się od nt 341-358 i od nt 2-21. Każde powtórzenie jest niedoskonałym palindromem, który pozwala na utworzenie struktury prętopodobnej lub w kształcie litery Y. Wiroid irezynowy (IrVd) nie posiada tej sekwencji powtórzeń, dlatego też wysunięto przypuszczenie, że wiroid ten mógł powstać w wyniku delecji jednego z powtórzeń w tym regionie u przodka wiroida. Poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce i inokulację Agrobacterium, określono korelacje tego regionu z pierwszymi etapami transkrypcji (.

P (patogenność).- Ten region ma odcinek oligopurynowy w górnej nici i odpowiadający mu odcinek oligopirymidynowy w dolnej nici większości pospiviroidów. To powstałe w ten sposób parowanie stanowi region strukturalny o niskiej stabilności termodynamicznej. Po zsekwencjonowaniu wariantów patogenności PSTVd, tylko niewielkie różnice w sekwencji w tym regionie były związane z ekspresją objawów, a region ten został nazwany VMR (Virulence Modulating Region). Ta domena jest związana z ekspresją objawów i charakteryzuje się sekwencją oligo (A5-6). Patogenność wiroidów od dawna analizowana jest pod kątem unikalnej struktury genomowego RNA o wysokiej liczbie par zasad. Zmiany sekwencji zlokalizowane w tej domenie mają dramatyczny wpływ na ekspresję objawów PSTVd ( . Jednak zmiany w pozostałych czterech domenach strukturalnych mogą również mieć znaczący wpływ na rozwój objawów . Tylko 40 z 359 nukleotydów w genomie PSTVd reprezentuje region modulujący patogenność. Odcinki 40-60 nt w górnej nici i 200-321 nt w dolnej nici, stanowią region częściowo dwuniciowy. Wiązanie kinazy białkowej aktywowanej dsRNA (PKR) z regionem P zostało odkryte wcześniej jako pierwotny czynnik patogenny. Jednak późniejsze prace ujawniły bardziej złożony scenariusz kontrolowany przez inne determinanty w pięciu domenach.

CCR.- Jest to najbardziej konserwatywny region wśród wiroidów. Ta konserwatywna domena centralna jest utworzona przez dwa odcinki konserwatywnych nukleotydów w górnej i dolnej nici, otoczone niedoskonałym odwróconym powtórzeniem w górnej nici. Domena ta jest kluczowa dla zaproponowanego mechanizmu replikacji i przetwarzania transkryptów RNA PSTVd (+) dłuższych niż długość jednostkowa. Struktura odpowiedzialna za przetwarzanie jest strukturą czterohelikalną z miejscem rozszczepienia/ligacji pomiędzy nukleotydami G95 i G96 .

V (Variable).-Jako najbardziej zmienny region, region ten ma największą zmienność sekwencji pomiędzy blisko spokrewnionymi wiroidami. Zawiera on pole G:C z minimum trzema parami G:C o nieznanej jeszcze funkcji. Granice domeny V zostały określone przez zmianę z niskiej homologii sekwencji do sąsiednich domen C i TR.

TR.- Sekwencyjne duplikacje prawego końca terminalnego na najmniejszym wariancie CCCVd dają początek dłuższym cząsteczkom; cząsteczki te istnieją w formach dimerycznych i kolistych. Zaproponowano, że mały motyw purynowy/pirymidynowy w tej domenie, który jest konserwowany u wszystkich członków rodzaju Pospiviroid, pośredniczy w transporcie systemowym. Na podstawie optycznych krzywych topnienia i badań kinetycznych stwierdzono, że wiroidy ulegają denaturacji w niefizjologicznie wysokich temperaturach w wysoce kooperatywnym procesie przejściowym, w wyniku dysocjacji natywnej struktury przypominającej pręt, co umożliwia tworzenie stabilnych struktur rozgałęzionych. Te stabilne szpilki do włosów nie są częścią struktury prętopodobnej.

Pętla E.- W centrum CCR znajduje się szczególna pętla wewnętrzna (98-102, 256-261 PSTVd). Pętla ta wykazuje homologię do pętli E eukariotycznego 5S RNA. Bezpośrednie naświetlanie promieniami UV liści pomidora zainfekowanych PSTVd i analiza RNA wykazały, że pętla E jest tworzona również in vivo. W strukturze przetwarzania, miejsce rozszczepienia znajduje się w pobliżu tetraloop zawierającej filogenetycznie konserwowaną sekwencję -GAA-, która jest również częścią pętli E.

Domena przetwarzania pętli E edytuje przetwarzanie wiroidów, z liniowym 148 nukleotydowym RNA obejmującym rdzeń domeny CCR i zawierającym 17 nukleotydową duplikację górnej nici. Mutacje zlokalizowane w obrębie tego motywu zmieniają specyficzność gospodarza lub patogenność wiroidów. Motyw ten jest zaangażowany w interakcje RNA-RNA i RNA-białko i występuje w szerokiej gamie RNA występujących w przyrodzie. Miejsca rozszczepienia w strukturze dają dwa 3′-nukleotydy w każdej nici. RNA klasy III wykazują wyraźną preferencję dla substratów o zwartej strukturze drugorzędowej. Monomeryczne (+) transkrypty CEVd, które gromadzą się w Arabidopsis thaliana posiadają takie właśnie terminy (Gas, et al. 2008). Dowody in vitro na jego związek z procesem ligacji wiroidów podczas replikacji uzyskano z inkubacji PSTVd (+) RNA z krótkim powtórzeniem górnej nici CCR. Ze względu na obecność formy kolistej zaproponowano, że enzymatyczne rozszczepienie i ligacja wynika z konserwowanej sekwencji – GAAA- (Baumstark, et al. 1997). Co ciekawe, motyw pętli E może być również zaangażowany w specyficzn± dla gospodarza patogenno¶ć wiroidów (Qi i Ding, 2003) oraz akumulację potomstwa (Zhong, et al. 2006). Wiadomo, że pętla ta jest częścią miejsca wiązania dwóch białek: czynnika transkrypcyjnego IIIA, który aktywuje transkrypcję 5S rRNA, oraz białka rybosomalnego L5 związanego z posttranskrypcyjną obróbką RNA z nukleoplazmy do nukleolu. Ostatnie dane wykazały, że L5 i TFIIIA z Arabidopsis thaliana wiążą PSTVd (+) RNA z takim samym powinowactwem, z jakim wiążą swoje 5S RNA, podczas gdy powinowactwo do chloroplastowego wiroidalnego RNA jest niższe (Eiras, et al. 2011); jednak pętla E nie jest konserwowana u wszystkich członków Pospiviroidae i pozostaje do ustalenia, czy alternatywne elementy pełnią podobną funkcję.

Hairpina I.-. U pospiviroidów, hostuwiroidów i kokadwiroidów górna nić CCR jest w stanie utworzyć termodynamicznie stabilną spinkę do włosów składającą się z dziewięciu par zasad, nazwaną spinką do włosów I. Pętla spinki do włosów I ma 14-15 nukleotydów i jest sekwencją palindromową. Wyniki uzyskane w systemie in vivo z wykorzystaniem linii Arabidopsis thaliana, wyrażających dimeryczne transkrypty CEVd, ujawniły, że miejsce rozszczepienia nici (+) znajduje się w górnym CCR (Daros i Flores 2004a; Gas, et al. 2007), w pozycji homologicznej do tej w PSTVd (Baumstark, et al. 1997). Ta konserwatywna sekwencja jest dodatkowo zaangażowana w import PSTVd do jądra (Abraitiene, et al. 2008; Zhao, et al. 2001).

Hairpin II.- Motyw ten znajduje się w obrębie domeny V i TL. Helisa ma długość 11-12 nukleotydów, a jej skład jest bogaty w zawartość G-C. Struktura ta jest nieobecna w CCCVd (Hadidi 2003). Mutageneza Site-directed w PSTVd wykazała, że motyw ten jest krytyczny dla infekcyjności i działa jako funkcjonalny element intermediatów replikacji nici (-) (Loss, et al. 1991; Qu, et al. 1993). Jego znaczenie funkcjonalne opiera się na krytycznej roli w infekcyjności i jest wysoce konserwatywny wśród Pospiviroidae. Motyw spinki do włosów II jest przyjmowany przez sekwencyjne składanie intermediatów nici (-) i jest niezbędny dla jej szablonowej aktywności w syntezie nici (+) podczas zdarzeń replikacyjnych (Candresse, et al. 2001).

Spinka do włosów III. Ta spinka do włosów została znaleziona tylko w PSTVd (Henco, et al. 1979), a motyw spinki do włosów IV został zidentyfikowany w CLVd (Owens, et al. 2003), jednak ich role funkcjonalne pozostają nieznane.

3.2. Avsunviroidae: determinanty patogeniczności, rybozymy młotkowe i elementy o wysokiej strukturze

ASBVd początkowo proponowano składać w wydłużoną konformację (Symons 1981), jednak późniejsze doniesienia wykazały, że domena lewego końca jest rozwidlona (Gast, et al. 1996). Inne wiroidy należące do tej rodziny również wykazują wielorozgałęzione przewidywalne stabilne konformacje i dowody na istnienie tego typu konformacji in vivo (Ambros, et al. 1998; Ambros, et al. 1999; Pelchat, et al. 2000; Rodio, et al. 2006; Yazarlou, et al. 2012). Gatunki z rodzaju avsunviroid nie wykazują znaczącego podobieństwa sekwencji z rodzajem Pelamoviroid; wspólne są jedynie konserwowane sekwencje z HHRz. ASBVd jest unikalnym wiroidem z zawartością G-C wynoszącą tylko ~38%, podczas gdy zawartość G-C PLMVd wynosi ponad 52% (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).

Determinanty patogeniczności. Wykorzystując genetykę odwrotną wykazano, że charakter sekwencji tetraloop (zamykającej trzon utworzony między nukleotydami 62 i 100) determinuje ekspresję objawów CChMVd. Dwa główne przykłady reprezentują tetraloopę (GAAA) znaną jako determinantę bezobjawową i tetraloopę (UUUC) uznaną za efektor objawowy. Analiza populacji klonów cDNAs wykazała, że szczepy objawowe mają insercję 12-13 nukleotydów w porównaniu do szczepów bezobjawowych. Pętla nukleotydów, która zamyka heliksy I i II znajduje się poza HHR i przyczynia się pod wpływem selekcji do szybszego splicingu RNA, aby umożliwić wydajne katalityczne samookleszczanie.

Hammerhead Ribozymes.-.Aktywność katalityczna tych RNA opiera się na zdolności ich obu polarnych nici do składania się w struktury młotkowe, które ułatwiają rozszczepienie specyficznego wiązania fosfodiestrowego poprzez transestryfikację, która daje 5′- hydroksylowe i 2′,2′ cykliczne terminy fosfodiestrowe (Hutchins, i wsp. 1986; Prody, i wsp. 1986). HHRz promują samowycinanie się w nici o długości jednostkowej multimerycznych intermediatów ES (Flores, et al. 2001). Rybozymy te, zamiast składać się z centralnego, konserwowanego rdzenia, otoczonego trzema dwuniciowymi helikami (I, II i III), zwykle zakończonymi krótkimi pętlami (1, 2, 3), przypominającymi literę Y, w której heliksy II i III są praktycznie współliniowe (Martick i Scott 2006).

Poprzednie badania przewidywane przez analizy in vitro i in vivo potwierdziły fizyczny kontakt między pętlami 1 i 2 i wykazały, że ta interakcja jest krytyczna przy niskich fizjologicznych poziomach Mg2+ (De la Pena i in., 2003; Khvorova i in., 2003). Nie wiadomo, czy etap ligacji jest również pośredniczony in vivo przez te motywy. Dowody in vitro wykazały, że mają one zdolność do przeprowadzania tej reakcji (Przybilski, et al. 2005; Przybilski i Hammann 2007a; Przybilski i Hammann 2007b).

Elementy o wysokiej strukturze.-. Współzmienność między pętlami szpilki do włosów najbardziej stabilnej struktury drugorzędowej dla sekwencji PLMVd ma potencjalną interakcję base-pairing między tymi dwoma szpilkami do włosów, sugerując przyjęcie przynajmniej w niektórych wariantach interakcji kissing-loop (Ambros i Flores 1998; Ambros, et al. 1998). Ostatnie badania in vitro potwierdzają tę interakcję (Dube, et al. 2010). Podej¶cie podobne do tego w PSTVd ujawniło, że kolejny element struktury trzeciorzędowej pomiędzy dwoma konserwowanymi nukleotydami znajduje się w sekwencji nici (+) PLMVd. Liście zainfekowane PLMVd napromieniowane UV potwierdziły istnienie tego elementu struktury trzeciorzędowej in vivo (Hernandez i in. 2006), ale jego rola funkcjonalna pozostaje nieznana. Monomeryczna forma liniowa ELVd (+) ma potencjał do przemieszczania się do jądra, a następnie do plastydów, gdzie zachodzi replikacja, co sugeruje, że przemieszczanie może być regulowane przez motyw RNA ograniczony do lewej domeny terminalnej ELVd (Pallas, et al. 2012).

.