As Características de Staphylococcus aureus Variante de Colónia Pequena Isolada de Mastite Crónica numa Quinta de Leite na Província de Yunnan, China
Abstract
Staphylococcus aureus é um agente causador principal que leva à mastite bovina e tem características fonotípicas específicas incluindo pequena colónia, crescimento lento, e diminuição da hemólise, por isso denominadas como as variantes de pequena colónia (SCVs). Das 30 amostras testadas dos casos crónicos de S. aureus, uma estirpe de SCV (S. aureus SCV22) foi isolada juntamente com as suas estirpes parentais (S. aureus11). S. aureus SCV22 mostrou uma taxa de crescimento lenta quando comparado com a estirpe parental. No entanto, os seus padrões de resistência eram semelhantes. Entretanto, S. aureus SCV22 retratou a menor taxa de apoptose nas células epiteliais mamárias bovinas. Estas descobertas do presente estudo apresentaram as características únicas de S. aureus SCV22 pela primeira vez na província de Yunnan, o que proporcionou uma base prófase para um estudo mais aprofundado sobre a patogénese de S. aureus SCV em mastite crónica.
1. Introdução
A mastite bovina é extremamente prevalecente entre as vacas leiteiras principalmente causada pelo Staphylococcus aureus patogénico, com uma enorme perda económica na produção leiteira. Uma hipótese inicialmente proposta por Proctor et al. mostrou que a infecção crónica ou recorrente estava associada a S. aureus SCVs . Antes de serem encontrados os SCVs de S. aureus, S. aureus era geralmente considerado como uma bactéria extracelular. Contudo, muitos novos relatórios mostraram que S. aureus SCVs possuía a capacidade de persistir intracelularmente em fagócitos não profissionais, tais como células epiteliais, fibroblastos, osteoblastos, e células endoteliais .
Tanto quanto é do nosso conhecimento, não foram documentados relatórios para o isolamento de S. aureus SCVs de vacas leiteiras na província de Yunnan, sudoeste da China, bem como a investigação relacionada. O objectivo deste estudo era explorar a persistência intracelular, a apoptose de células epiteliais mamárias, e o estabelecimento do modelo de mastite em S. aureus SCVs, e os resultados proporcionariam uma base prófase para melhor conhecer os mecanismos de infecção de S. aureus SCVs em mastite crónica em estudos posteriores.
2. Materiais e Métodos
2.1. Isolamento e Identificação de S. aureus e SCVs do Leite
Amostras de leite cru () foram recolhidas assepticamente de vacas alimentadas dispersas numa exploração leiteira na cidade de Kunming na província de Yunnan. Consequentemente, todas as amostras foram cultivadas em Trypticase Soy Agar (TSA, HUANKAI, Guangzhou, China) complementadas com 5% de sangue de ovelha (Ruite, Guangzhou, China) e depois cultivadas a 37°C durante 24 h e 48 h, respectivamente. S. aureus foi identificado de acordo com as características fonotípicas de ser grande, cremoso, e forçosamente hemolítico em TSA com 5% de sangue de ovelha. Foram também recolhidas potenciais colónias de SCVs de colónias minúsculas, não pigmentadas e não hemolíticas sobre TSA com 5% de sangue de ovelha. Os isolados de potenciais SCVs foram subcultivados em TSA durante dez gerações para avaliar a sua estabilidade. Os SCVs e as suas estirpes parentais foram principalmente testados quanto às propriedades bioquímicas de rotina; depois os potenciais SCVs foram identificados como S. aureus SCVs com o gene (nuc, nucA, e 16srDNA) por amplificação múltipla por PCR (Quadro 1). Os S. aureus SCV identificados e as suas estirpes parentais foram denominados S. aureus SCV22 e S. aureus11, respectivamente. Todos os isolados foram armazenados a -80°C em Caldo de Soja Trypticase (TSB, HUANKAI) complementados com 25% de volumes de glicerina (HUANKAI) para posterior investigação.
| Gene de propósito | Sequência | Comprimento do fragmento (bp) | |
| 16SrDNA | Upstream primer: 5′-GGCGTTGCTCCGTCAGGCTT-3′ | 375 | 54°C |
| nucA | Upstream primer: 5′-CGCTTGCTATGATTGTGTGGTAGCC-3′ | 239 | |
| nuc | primário de upstream: 5′-TCGTCAAGGCTTGGGCTAAAGTTGC-3′ | 126 | |
2.2. Ensaio de Auxotrofismo
Teste deuxotrofia dos SCVs foi realizado em ágar Mueller-Hinton (MHA, Difco BD, Pequim, China) com 1 μg/mL de hemin (Sigma, Xangai, China), 1 μg/mL de timidina (Sigma), 1 μg/mL de bissulfito de sódio menadionado (Sigma), e 100 μg/mL de tiamina como descrito anteriormente . Foram identificados SCVs de Auxotrofismo, que mostraram o crescimento semelhante às suas estirpes parentais após incubação nocturna a 37°C.
2.3. Curvas de Crescimento Bacteriano
SCVs e as suas estirpes parentais foram analisadas em triplicado para características da curva de crescimento . As estirpes criopreservadas foram inoculadas em 10 mL de caldo de TSB durante a noite a 37°C. 1 mL de cultura nocturna foi transferido para um frasco contendo 200 mL de TSB e depois incubado a 37°C num agitador rotativo (150 rpm). O crescimento bacteriano foi determinado medindo a DO 600 nm por 4 horas.
2,4. Cultura celular
Todos os reagentes foram adquiridos às Indústrias Biológicas (BI, Israel). As células epiteliais primárias mamárias bovinas (Procell, Wuhan, China) foram cultivadas em meio de crescimento de células epidérmicas suplementadas com 10% de soro fetal de vitelo (FCS, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha), factor de crescimento epidérmico (0,1 ng/mL), insulina de porco, e hidrocortisona. As células congeladas foram ressuscitadas na placa de cultura celular com peça trepadora de células com antecedência. Os MECs foram utilizados após 3 passagens para as respectivas experiências.
2,5. Experiências de infecção
Para experiências de infecção, as bactérias de S. aureus SCV22 e S. aureus11 foram cultivadas durante a noite a 37°C em TSA complementadas com 5% de sangue de ovelha, colhendo uma única colónia para cultivar em meio líquido durante 4 h, depois colhendo as bactérias, suspendendo-as com DMEM/F12 (sigma), e depois ajustando a concentração de thalli a 108 ufc/ml. Quando as células foram cultivadas até 80%, uma célula foi infectada utilizando 100 bactérias. O teste de infecção foi terminado após 3 h.
2.6. Apoptose
As células infectadas foram tingidas com Anexo no kit V-FITC/PI (Beyotime, Xangai, China) . A quantidade de células apoptose foi medida por citometria de fluxo (BD FACSCalibur, EUA) e analisada com o software Cellquest Pro.
2.7. Microscopia Electrónica de Varrimento
As células infectadas foram lavadas 5 vezes com PBS e as células foram fixadas com tampão de fosfato de glutaraldeído. Em seguida, a desidratação celular foi realizada durante 15 minutos em cada solução, utilizando um etanol graduado de 30% a 100%. A subida das células foi seca de acordo com o método de secagem em ponto crítico, antes de ser revestida com ouro em aE-1010 Ion Sputter Coater (Hitachi, Japão). Finalmente, a mudança das células epiteliais mamárias foi observada por microscopia electrónica de varrimento S-3000N (Hitachi, Japão).
2,8. O Ensaio de Persistência Intracelular
A experiência de infecção foi realizada novamente e incubada durante 3 h a 37°C com 5% de CO2 para permitir a fagocitose e a adesão de S. aureus SCV22 e S. aureus11. A placa celular testada foi lavada com PBS estéril e foram adicionados 100 mg/mL de gentamicina e 50 mg/mL de penicilina, respectivamente. A placa celular foi lavada novamente e a lisostafina foi adicionada para eliminar bactérias extracelulares e depois incubada durante 30 min, 3 h, 9 h, e 12 h, respectivamente. Em cada momento, as células foram lavadas três vezes com PBS para remover a lisostafina, a que se seguiu a adição de 50 μL 0,25% de Triton X-100 para espalhar células epiteliais e libertar bactérias intracelulares. O reagente de lisagem celular foi diluído com água esterilizada. O diluente de 100 mL foi espalhado sobre a placa AGAR. O número de unidades formadoras de colónias intracelulares (UFC) foi contado após S. aureus SCV22 e SASCV11 terem crescido de um dia para o outro a 37°C em cada ponto.
2,9. Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana
Susceptibilidade antimicrobiana de S. aureus SCV22 foi determinada estritamente com 10 antibióticos de acordo com a instrução do kit de susceptibilidade aos medicamentos (Tianhe), enquanto a estirpe padrão de S. aureus (ATCC29213, Tianhe, Hangzhou, China) foi utilizada como controlo de qualidade (QC).
3. Resultados
3.1. Isolamento e identificação de S. aureus11 e S. aureus SCV22 do leite
Das 30 amostras recolhidas de vacas leiteiras Holstein, foram encontrados 8 isolados de S. aureus11 típicos suspeitos. Foram subcultivados a 37°C durante 16 h em TSA com 5% de sangue de ovelha. O resultado mostrou que todos os isolados mostraram as características morfológicas típicas como (4 mm) β colónias hemolíticas e cremosas (Figura 1(b)), e as bactérias eram cocos Gram-positivos e dispostos em cachos semelhantes a uvas sob microscópio ligeiro. Além disso, o teste de catalase em TSA puro incubado a 37°C durante 16 h foi fortemente positivo. A prevalência de coagulase foi de 100% pelo kit comercial (Staphylase Test Kit, Oxoid, Pequim, China).
(a)
(b)
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Sem oito isolados de S. aureus, um era putativo SCV22. As colónias de SCV11 com pontos (0,3 mm) não foram pigmentadas e não apresentaram uma hemólise extremamente ligeira até serem incubadas durante 24 h a 37°C em TSA com 5% de sangue de ovelha (Figura 1(a)). Sob o microscópio de luz, estes potenciais SCV11 pareciam ser idênticos ao típico S. aureus. Para o SCV11, o teste de catalase também foi positivo, enquanto que a coagulase não foi detectada. No decurso de uma passagem contínua durante dez gerações, estes resultados foram estáveis até à passagem de 10 gerações.
Todos os isolados foram positivos ao teste PCR múltiplo (Figura 2). A análise da sequência de 16S rRNA mostrou que o gene de S. aureus SCV22 e as suas estirpes parentais são homólogos com a sequência de S. aureus publicada.
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3.2. Ensaio do auxotrofismo
A análise do auxotrofismo de S. aureus SCV22 revelou uma dependência da timidina; as estirpes de auxotrofismo estavam próximas das suas estirpes parentais em MHA com 1 μg/mL de timidina. Contudo, o S. aureus SCV22 foi negativo para hemin, menadiona, e tiamina (Figura 3).
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3.3. Curvas de Crescimento Bacteriano
De acordo com as curvas de crescimento de S. aureus SCV22 e as suas estirpes parentais (doravante S. aureus11) cultivadas em TSB puro, S. aureus11 mostraram uma curva de crescimento bacteriano típica. Em contraste, S. aureus SCV22 mostrou uma curva de crescimento linear, que teve uma fase de atraso prolongada, mas a fronteira entre a fase de atraso e a fase de registo não pôde ser distinguida devido a nenhum ponto de ruptura mostrado na Figura 4.
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3.4. Ensaio intracelular
Os ensaios para S. aureus SCV22 e S. aureus11 foram feitos em triplicado para comparar e quantificar a sua capacidade de persistir intracelularmente dentro da linha de células epiteliais primárias mamárias bovinas. A medição da UFC foi realizada nos pontos de 0,5 h, 3 h, 9 h, e 12 h, respectivamente (Figura 5). Deste modo, a prevalência de persistência a partir do ponto de tempo de 3 h estava a tornar-se diferente entre S. aureus SCV22 e S. aureus11, e o número de UFC de S. aureus SCV22 era relativamente estável (Figura 6).
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3.5. Apoptose
Em comparação com o grupo de controlo, as taxas de apoptose de células epiteliais primárias mamárias bovinas nos grupos de infecção de S. aureus SCV22 e S. aureus11 aumentaram significativamente (), e a diferença entre os grupos de S. aureus SCV22 e os grupos de S. aureus11 foi também estatisticamente significativa () (Figura 7).
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3.6. Microscopia Electrónica de Varredura
Sob a microscopia electrónica, as células de controlo foram cultivadas normalmente. Nos grupos de infecção de S. aureus11, as células tornaram-se peças redondas e aglomeraram-se após a queda, a sua citomembrana rompeu, e o núcleo foi incapaz de distinguir devido à sua murchidão. As células dos grupos de infecção por S. aureus SCV22 tendiam a descascar, mas a membrana celular estava intacta, e não foi encontrada nenhuma extravasação do citoplasma (Figura 8).
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3.7. Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana
O ATCC25923 era sensível a 10 antibióticos. Pelo contrário, o S. aureus SCV22 tinha uma resistência a seis antibióticos; os mesmos resultados foram dados em testes repetidos (Quadro 2).
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SXT: sulfametoxazol trimethoprim.
4. Discussões
A mastite bovina é muito comum entre a maioria das explorações de vacas causadas por S. aureus, especialmente as mastites crónicas. Muitos relatórios mostraram que uma pequena variante de colónia de S. aureus com características fonotípicas especiais era a principal bactéria patogénica que conduzia à mastite crónica. No presente estudo, embora S. aureus SCV22 e S. aureus11 tivessem características fenotípicas e curvas de crescimento diferentes, os seus fragmentos alvo eram os mesmos por amplificação múltipla de PCR.
Desde que o fenómeno dos SCVs foi encontrado a partir de estirpes de Eberthella typhosa por Jacobsen em 1910 , vários SCVs de diferentes bactérias foram relatados . Entre elas, os SCVs de S. aureus foram estudados de forma selvagem; as suas principais características são pequenas colónias, crescimento lento, formação de biofilmes, sobrevivência em células hospedeiras cronicamente, e mesmo redução da sensibilidade aos antibióticos, que são consistentes com os nossos resultados, dos quais pequenos fenótipos e crescimento lento dos SCVs são principalmente causados por defeitos metabólicos , e dois tipos podem ser divididos, incluindo o defeito de transferência de electrões e o defeito de síntese da timina. O primeiro é o típico auxotrofio; o fenótipo normal pode ser formado pelo fornecimento de menadiona ou hemin. Neste estudo, o resultado mostrou que S. aureus SCV22 era S. aureus SCV22 dependente de timina; este tipo tinha sido relatado anteriormente por doentes com fibrose cística (FC).
No presente estudo, S. aureus SCV22 tinha uma alta resistência ao SXT, enquanto as suas estirpes parentais eram sensíveis. SXT pode interferir com a síntese de ácido tetrahidrofólico para inibir o crescimento de S. aureus . A fim de resistir ao SXT, os SCVs dependentes da timina absorveram a timina em extracelular e acabaram por sobreviver. Este fenómeno dos SCVs dependentes da timina pode estar relacionado com a mutação da perturbação genética da thyA, porque a timidase sintetase do ácido tiamidílico e o ácido tetrahidrofólico codificado pelo gene são coenzimas importantes para a timidase sintetase do ácido tiamidílico.
Neste estudo, os resultados do ensaio intracelular, teste de apoptose, e microscopia electrónica de varrimento indicaram que os SCVs de S. aureus persistiram mais tempo em fagócitos não-profissionais sem danos profundos, como anteriormente relatado . Esta característica evitou com sucesso a imunidade do hospedeiro e a terapia antibiótica que explicava parcialmente a sua resistência aos antibióticos e o fracasso da resposta imunitária mediada por anticorpos (AMIR).
Em conclusão, a mastite crónica é generalizada nas explorações de vacas em Yunnan provavelmente devido à tecnologia de produção livre, antiquada, falta de pessoal técnico, e abuso de antibióticos. No estudo, S. aureus SCVs isolados de vacas leiteiras foram relatados em Yunnan pela primeira vez, os quais estão fortemente ligados à mastite crónica. Até à data, não existe tratamento para eliminar exaustivamente a mastite crónica na produção; por conseguinte, devem ser realizados mais estudos para melhor conhecer os mecanismos de infecção de S. aureus SCVs em mastite crónica.
Conflito de interesses
Não há conflito de interesses.
Conhecimento
Esta investigação foi apoiada pelo Projecto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31260629).