Efeitos da restrição dietética de metionina e cisteína nos biomarcadores plasmáticos, factor de crescimento 21 do fibroblasto sérico e expressão do gene do tecido adiposo em mulheres com excesso de peso ou obesidade: um estudo piloto randomizado duplo-cego controlado

p> Gráfico de progresso dos participantes no estudo e progressão. Os grupos Met/Cys tiveram uma ingestão baixa, média ou alta de metionina e cisteína. 1Um participante não completou a última visita (V4), mas todos os dados obtidos em V1-V3 foram incluídos em análises relevantes

Os participantes foram atribuídos aleatoriamente num 1:1:1 a 1 de 3 grupos de intervenção que foram severamente restringidos (Met/Cys-low), moderadamente restringidos (Met/Cys-medium), ou elevados em conteúdo de metionina e cisteína (Met/Cys-high). A aleatorização e atribuição foram realizadas por investigadores não relacionados com o estudo utilizando o pacote “blockrand” em R (R para computação estatística, Viena). Foi utilizado um tamanho de bloco de 12 para assegurar um número semelhante de participantes por grupo. Assim, o pessoal do estudo foi cego à atribuição por grupo. Os detalhes da composição das dietas são descritos abaixo. A amostragem de sangue foi realizada na linha de base (visita 1), e após 1 (visita 2), 3 (visita 3) e 7 (visita 4) dias. Foram realizadas medições clínicas e antropométricas e biópsias de gordura na visita 1 e na visita 4. Antes da visita à linha de base, todos os participantes realizaram um período de 1 semana com instruções para evitar a ingestão de peixe gordo, óleo de fígado de bacalhau, suplementos de ácidos gordos n-3 e outros suplementos, para moderar o seu consumo de álcool (máximo 2 unidades 3 vezes por semana), e para manter o seu nível de actividade física normal. Na véspera do início do estudo, foi recomendado aos participantes que evitassem uma actividade física extenuante, que se abstivessem de álcool e jejuassem 10 h antes da colheita de amostras de sangue.

Todos os participantes deram o seu consentimento informado por escrito. O estudo foi conduzido de acordo com as directrizes da Declaração de Helsínquia, e o Comité Regional de Ética para a Investigação Médica no Sudeste da Noruega aprovou o estudo (número de referência: 2015/634). O estudo foi registado na US National Library of Medicine Clinical Trials registration (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03629392, data de registo: 14/08/2018).

Intervenções dietéticas

A dieta foi baseada na intervenção de um estudo piloto anterior com algumas modificações. A dieta foi ajustada às Recomendações de Nutrientes Nórdicos para as fêmeas com idades compreendidas entre os 18-60 anos com uma necessidade média de energia correspondente a cerca de 2200 kcal/d . Uma vez que o principal objectivo do estudo era comparar dietas contrastantes em teor de aminoácidos de enxofre, o número total de calorias era o mesmo para cada participante. Uma visão detalhada da composição nutritiva da dieta é apresentada no ficheiro adicional 1. As refeições foram desenvolvidas para se adequarem a uma cozinha norueguesa e aos ingredientes disponíveis. Um menu típico é apresentado no ficheiro adicional 2.

Aminoácidos de enxofre são encontrados na maioria dos alimentos mas são especialmente elevados em produtos animais. Assim, as dietas eram vegetarianas e consistiam em alimentos vegetais. A fim de alcançar a ingestão recomendada de proteínas e micronutrientes, todos os participantes receberam uma bebida em pó como suplemento dos alimentos. O suplemento continha todos os carbohidratos, vitaminas, minerais e oligoelementos essenciais e não essenciais de aminoácidos, excluindo aminoácidos sulfurados (XMET XCYS Maxamaid®, Nutricia Norway AS, Oslo, Noruega). Assim, o desenho da intervenção foi duplamente cego. Para melhorar o sabor das misturas das bebidas, os participantes adicionaram um pó aromatizante (Flavour Modjul® da Nutricia) com sabor a groselha preta ou laranja.

Concebemos três dietas com diferentes teores de aminoácidos sulfurados regulando a quantidade de metionina e cisteína em pó adicionada à dieta. Isto resultou numa dieta com baixo (Met/Cys-baixo), médio (Met/Cys-médio) ou alto (Met/Cys-alto) teor de aminoácidos de enxofre. O grupo Met/Cys-alto foi considerado o grupo de controlo e foi baseado em estimativas de ingestão em dietas com elevado teor de proteínas . Os grupos Met/Cys-low e Met/Cys-medium foram seleccionados com base num objectivo global de alcançar uma restrição severa e moderada em comparação com o grupo Met/Cys-high. Todas as dietas cumpriam a recomendação mínima da OMS de ingestão diária de aminoácidos de enxofre de 15 mg/kg , e correspondiam a um conteúdo que era em média de 72% e 35% em relação ao grupo Met/Cys-alto. Não foi adicionado pó à dieta Met/Cys-low; assim, o teor médio de aminoácidos de enxofre na dieta era de 1,6 g/dia (0,8 g/d de metionina e 0,8 g/d de cisteína). Uma visão geral pode ser encontrada no ficheiro adicional 3. Na dieta Met/Cys-medium, adicionámos um total de 2,04 g de pó (0,68 g de metionina e 1,36 g de cisteína) resultando numa ingestão média diária de 3,64 g/d (1,48 g/d de metionina e 2,16 g/d de cisteína). Na dieta Met/Cys-high adicionámos 4 g de pó (1,32 g de metionina e 2,68 g de cisteína), com uma ingestão média total de 5,6 g/d de (2,12 g/dia de metionina e 3,48 g/dia de cisteína).

Todos os alimentos e suplementos, incluindo um menu com receitas para cada refeição e informações sobre a ingestão diária, foram fornecidos aos participantes e foram entregues na sua morada por um serviço de entregas.

Parâmetros antropométricos

Um peso de impedância bioeléctrica (Seca mBCA515, Hamburgo, Alemanha) foi utilizado para medir o peso corporal e calcular o IMC.

Amostras de sangue e urina e ensaios bioquímicos

Amostras de sangue venoso foram colhidas de cada participante nos dias 0, 1, 3 e 7 após um jejum nocturno. Descrição da amostragem de sangue, e os ensaios de aminoácidos foram relatados em detalhes anteriormente . O sangue foi recolhido em 2 tubos de vácuo revestidos com EDTA para medições de aminoácidos totais, livres (não ligados), e livres oxidados e reduzidos de homocisteína, cisteína e glutationa, e S-adenosilmetionina e S-adenosilomocisteína. Para reter os tióis, um tubo continha N-etilmalemida 150 mmol/L a 10% do volume do tubo . Imediatamente após a retirada, o sangue foi centrifugado durante 5 min a 4 °C, seguido de precipitação com ácido 5-sulfosalicíclico a 10%, com a alíquota sobrenadante resultante e armazenado a – 80 °C até à análise.

Amostras de sangue para medição do colesterol total, colesterol lipoproteico de baixa densidade (LDL-C), colesterol lipoproteico de alta densidade (HDL-C) e triglicéridos, apolipoproteína A1 (apoA1), apolipoproteína B (apoB), glicose, e insulina foram medidas no Departamento de Bioquímica Médica (Hospital Universitário de Oslo Rikshospitalet, Oslo, Noruega) por métodos colorimétricos e/ou enzimáticos (analisador Cobas c702, Roche Diagnostics International Ltd, Rotkreuz, Suíça). As concentrações de soro FGF21 foram medidas pelo R&D Systems Human FGF-21 Quantikine ELISA com CV intra-ensaio: 2,9-3,9% e CV inter-ensaio: 5,2-10,9%.

Ensaios de aminoácidos

Total (plasma e urina), livre reduzido/oxidado (plasma) e não ligado (plasma) metionina, homocisteína, cisteína, cistathionina, taurina e glutationa, bem como S-adenosilmetionina e S-adenosilmocisteína foram medidos por espectrometria de massa líquido-tandem (LC-MS/MS) como descrito em detalhe numa publicação anterior . Os coeficientes de variação para o plasma total e aminoácidos de enxofre urinário foram de 3,4-6,7%. Para SAM e SAH de plasma, os coeficientes de variação foram de 2-3%, e 4-6% para a fracção total não ligada, representando as concentrações livres combinadas reduzidas e dissulfuretos. A fracção ligada foi calculada subtraindo a concentração não ligada da concentração total de plasma.

ensaios de ácidos gordos

Amostras de plasma, descongeladas no frigorífico durante a noite, foram vortexadas, centrifugadas e pipetadas em frascos. Foi adicionado padrão interno (triheptadecanoina) e as amostras foram metiladas com 3 N HCl em metanol. As FAMEs foram extraídas com hexano, depois as amostras foram neutralizadas com 3 N KOH em água. Após a mistura e centrifugação, a fase de hexano foi injectada no GC-FID. A análise foi realizada num GC 7890A com um injector split/splitless, um amostrador automático de líquidos 7683B, e detecção de ionização de chama (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). As separações foram realizadas numa coluna SP-2380 (30 m × 0,25 mm i.d. × 0,25 µm de espessura de película) da Supelco. Como marcador substituto da actividade SCD1 do fígado, examinámos o índice SCD-16 do plasma estimado pelo produto/precursor-razão de ácidos gordos no plasma (C16:1n-7/C16:0).

Possibilidade e avaliaçãoiet

A classificação subjectiva dos participantes e a avaliação das dietas foram recolhidas com questionários que incluíam escalas analógicas visuais fornecendo uma gama de pontuações de 0 a 100, com 0 = “sem dor/assintoma/grande satisfação” e 100 = “máxima dor/assintoma/dissaboração”.

Biópsias de tecido adiposo subcutâneo

Tecido adiposo subcutâneo foi obtido da região periumbilical através de um procedimento de biopsia por sucção. A pele foi esterilizada e uma área semi-circular da pele e subcutis foi anestesiada injectando 5 mL de um anestésico local (Xylocain 10 mg/mL AstraZeneca, Södertälje, Suécia). Uma agulha (Sterican 2.10 × 80, Ref. No. 04665473, B Braun, Melsungen, Alemanha) ligada a uma seringa de vácuo foi inserida no tecido adiposo subcutâneo. Biópsias de tecido adiposo subcutâneo foram então dissecadas numa placa de alumínio gelado para remover sangue e outros materiais antes de as alíquotas serem subsequentemente congeladas em criotubos de 1,5 mL e armazenadas a – 80 °C.

Isolação de RNA, síntese complementar de DNA e PCR quantitativa em tempo real

RNA de tecido adiposo congelado foi extraído usando TRIzol (thermoFisher) e RNeasy lipid Tissue mini kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade e qualidade do RNA foram monitorizadas utilizando um Espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US). Um valor RIN de > 7.0 foi considerado aceitável para proceder com a análise qPCR.

RNA isolado (250 ng) foi transcrito de forma inversa para ADN complementar utilizando o kit de Transcrição Inversa de Alta Capacidade cDNA (Applied Biosystems). A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizada com 2,5 µL de cDNA diluído (12.5 µL de RNA) misturado com 10 µL de Kapa SYBR FAST qPCR Master Mix Universal (KapaBiosystems, Wilmington, MA, US), ou 9 µL de cDNA diluído (25 ng de RNA) e 1 µL de ensaios pré-desenvolvidos de Expressão Genética TaqMan foram misturados com 10 µL de TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US), num Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real Bio-Rad CFX96 Touch™ (Laboratórios Bio-Rad, Hercules, CA, US).

Fases de ensaio para reacções Kapa SYBR FAST qPCR foram concebidas com o software Primer-BLAST (NCBI, Bethesda, MD, US). As sequências de Primer estão listadas no ficheiro adicional 4. Foram utilizados iniciadores e conjuntos de sondas pré-desenvolvidos (ensaios TaqMan) para analisar os níveis de mRNA dos seguintes genes alvo (símbolo genético oficial entre parêntesis): Leptin (LEP), Hs00174877_m1; PR/SET domínio 16 (PRDM16), HS00922674_m1; e ribosomal protein lateral stalk subunit P0 (RPLP0), HS9999902_m1. A expressão relativa do mRNA alvo foi normalizada para um dos dois genes de gestão doméstica, TBP e RPLP0, e quantificada usando o método ∆∆Ct.

Resultados

Os resultados primários foram alterações nas concentrações plasmáticas de aminoácidos de enxofre e expressões de mRNA relevantes para o metabolismo de aminoácidos de enxofre e lipídios no tecido adiposo. No protocolo original, especificámos a expressão de proteínas como resultados primários, mas devido a desafios metodológicos, decidimos inicialmente proceder a análises de mRNA. Incluímos os mRNAs que se demonstrou serem afectados pela restrição de metionina e cisteína em estudos pré-clínicos . Além disso, incluímos os mRNAs envolvidos na regulação do metabolismo da cisteína para avaliar se os mecanismos compensatórios são activados quando a ingestão alimentar de metionina e cisteína é restringida, como foi relatado em modelos animais . Finalmente, avaliámos o FGF21, o índice SCD-16, bem como a conformidade e viabilidade da dieta auto-relatada.

Análise estatística

Testes de hipotese nula são activamente desencorajados nos ensaios-piloto, no entanto, porque analisámos uma vasta gama de resultados potenciais com relevância para um futuro estudo em grande escala, comunicámos valores p e intervalos de confiança (IC), mas sublinhamos que estas estimativas devem ser interpretadas com cuidado, de acordo com a declaração CONSORT para a comunicação de ensaios clínicos e ensaios-piloto . Os resultados com p > 0,05 mas com IC indicativas da direcção do efeito, e de acordo com os relatórios de estudos pré-clínicos, foram considerados significativos para a concepção de um estudo à escala real. Com base na declaração do CONSORT para a notificação de ensaios clínicos, bem como nas recomendações da Altman e outros, não realizámos testes de significância para covariates de base.

As concentrações de aminoácidos plasmáticos e soro FGF21 foram medidas repetidamente (dia 0, 1, 3 e 7), e utilizámos modelos de regressão linear mista para ajustar a variabilidade dentro do sujeito. Os modelos incluíram os respectivos aminoácidos no plasma ou soro FGF21 como variável dependente, e grupo, tempo e o seu termo de interacção (grupo × tempo) como variáveis fixas e independentes. O ID do sujeito foi adicionado ao modelo como um efeito aleatório. Um termo quadrático de tempo (tempo2) e a sua interacção com o grupo foi adicionado aos modelos de resultados, incluindo os aminoácidos (grupo × tempo2). Além disso, devido ao pequeno tamanho da amostra, esperavam-se diferenças de base e os modelos incluindo aminoácidos e FGF21 foram ajustados em conformidade. Assumiu-se uma estrutura de covariância não estruturada com base no critério de informação da Akaike. Os resíduos dos modelos foram normalmente distribuídos, e utilizámos os dados brutos para análise. Finalmente, porque comparámos o Met/Cys-low e Met/Cys-medium com o Met/Cys-high independentemente, foram construídos modelos separados. As principais análises de resultados foram traçadas utilizando as previsões lineares médias e pontos de previsão individuais dos modelos lineares mistos e o valor de p para interacção.

Baseline demográfica e medições laboratoriais de rotina são apresentadas como medianas (intervalos). O efeito da intervenção dietética nas variáveis laboratoriais de rotina e o índice SCD-16 foram avaliados com análise de covariância (ANCOVA) ajustada para concentrações de base dos covariatos. Os resíduos do modelo não foram normalmente distribuídos como avaliados visualmente pelos histogramas, e por isso transferimos os covariates antes da análise, o que resultou em resíduos do modelo normalmente distribuídos. Os resultados são apresentados em tabelas como a diferença média marginal estimada, transformada por trás, do grupo Met/Cys-high com os valores CI e p correspondentes. Uma vez que as estimativas são retro-transformadas, são dadas em %. A comparação das alterações na expressão do mRNA foi realizada em valores log2-transformados 2-ΔCT e foram avaliados com ANCOVA ajustado para diferenças na expressão de base. Os grupos Met/Cys-low e Met/Cys-medium foram comparados com o grupo Met/Cys-high, que serviu como grupo de referência. As estimativas são apresentadas como alteração log2 vezes com pontos individuais. Identificámos um outlier com um modelo homeostático muito elevado de resistência à insulina (HOMA-IR) valores na linha de base (> 6.0). Uma vez que a insulina pode ter efeitos profundos no tecido adiposo subcutâneo, apresentámos análises com e sem este participante. Realizámos análises adicionais ajustadas a desequilíbrios aparentes devido a uma aleatorização infeliz da idade, IMC e triglicéridos. Como a inclusão destes covariatos não alterou materialmente as estimativas de efeito, não os incluímos nos modelos finais.

Calculámos os coeficientes de correlação de Spearman e o IC entre os aminoácidos de enxofre e a expressão do mRNA do tecido adiposo subcutâneo.