Homeobox Genes in Embryogenesis and Pathogenesis
A palavra grega “homeo” significa da mesma forma, e os genes Drosophila homeotic (ou HOM) são assim denominados devido à sua capacidade, quando mutantes, de transformar um segmento do corpo do insecto na semelhança de outro. Por exemplo, os mutantes com perda de função do gene Ultrabithorax (Ubx) levam à transformação do terceiro segmento torácico portador de halteres (pequenos equilibradores, ver fig. 1) em direcção a um segundo segmento torácico com asas, gerando assim moscas de quatro asas (revisto emRefs. 1 e 4). O trabalho pioneiro de E. B. Lewis(5) demonstrou que a função normal dos genes homóticos é atribuir identidades espaciais (ou posicionais) distintas às células em diferentes regiões ao longo do eixo anteroposterior da mosca, e que é a combinação de genes homóticos (ou código homético) expressos numa determinada célula que “lhe diz” que pertence à cabeça, tórax ou abdómen da mosca.
organização genómica e padrões de expressão colinear dos genes Drosophila HOM e dos genes Hox dos mamíferos. Representação esquemática do complexo homeota Drosophila (HOM-C), os quatro complexos humanos Hox e um hipotético complexo homeotativo ancestral são exibidos mostrando as suas possíveis relações filogénicas. Cada gene é representado por uma caixa colorida. Os domínios de expressão dos genes HOM/Hox são esquematizados numa mosca e no CNS e prevertebrae de um feto humano (extrapolados a partir de dados no rato). Por razões de clareza, a sobreposição parcial entre as transcrições dos genes HOM nos segmentos torácico e abdominal da mosca e a sobreposição dos domínios de expressão dos genes Hox dos mamíferos ao longo do eixo do corpo não são representados; por conseguinte, cada cor destina-se a mostrar o domínio de expressão anteriormal de uma dada subfamília. As abreviaturas dos genes HOM são: labial, labial; pb, proboscipedia; Dfd, Deformed; Scr, Sex combs reduzido; Antp, Antennapedia; Ubx, Ultrabithorax; abd-A, abdominal-A; Abd-B, Abdominal-B.
Os genes dos mamíferos Hox são definidos em virtude da sua homologia com os genes do complexo homótico (HOM-C) de Drosophila. A análise dos genes do rato e dos Hox humanos indica que existem pelo menos 39 deles organizados em quatro grupos, HoxA, HoxB, HoxC, e HoxD, cada um localizado num cromossoma diferente (por exemplo, cromossomas humanos 7, 17, 12, e 2, respectivamente), e compreendendo 9-11 genes (Fig. 1). Com base nas semelhanças de sequência e posição relativa no complexo, os genes Hox individuais dentro dos diferentes grupos podem ser alinhados entre si e com os genes do grupo Drosophila HOM-C. Estas semelhanças sugerem que os quatro aglomerados de mamíferos provavelmente surgiram a partir de um único complexo ancestral, predando a divergência entre artrópodes e cordas há 600 milhões de anos atrás, primeiro pela expansão do aglomerado através da duplicação de genes laterais (causada por exemplo pelo cruzamento desigual durante a meiose) e segundo, durante a transição de cefalocordatos para vertebrados, através da duplicação dos aglomerados por duplicação cromossómica ou poliploidização .
Em embriões de mamíferos, a expressão mais antiga dos genes Hox pode ser detectada na gastrulação. Os genes Hox são expressos nas três camadas germinativas com domínios sobrepostos que se estendem desde a extremidade caudal do embrião até um limite anterior agudo que é específico para cada gene Hox. Os genes Hox estão dispostos na mesma ordem ao longo dos cromossomas que são expressos ao longo do eixo ântero-posterior do embrião, ou seja, os genes que estão localizados 5′ nos aglomerados são expressos mais posteriormente, enquanto que os genes mais 3′ localizados são progressivamente expressos em regiões mais anteriores. Significativamente, esta correlação, denominada “colinearidade espacial”, também se aplica aos genes homóticos de Drosophila (revista emRef. 6)(Fig. 1).
Genes Hox em padrões de esqueleto axial. Na ausência de qualquer mutação natural óbvia nos genes vertebrados Hox, foi o desenvolvimento de ratos transgénicos e de tecnologias de direccionamento de genes que permitiram a geração de mutações tanto da linha germinal de ganho de funções como de perda de funções no rato(7, 8).
Em Drosophila, a expressão ectópica de um gene homeotativo resulta frequentemente em transformações homeotativas posteriores. Por exemplo, os mutantes de ganho de função do Ubx (Fig. 1) levam à transformação do segundo em terceiro segmento torácico com a transformação das asas em segundo par de halteres. Do mesmo modo, a expressão ectópica do gene Antennapedia (Antp) resultante de uma inversão cromossómica espontânea, colocando a região codificadora de proteínas deste gene sob o controlo de um promotor heterólogo, leva à conversão da antena em pernas mesotorácicas (segunda torácica) (revista emRef. 1). A primeira evidência de uma conservação evolutiva funcional dos genes Hox dos mamíferos foi fornecida por duas experiências de ganho de função realizadas por M. Kessel et al.(9) no Instituto Max Planck em Göttingen e por T. Lufkin et al.(10) no nosso grupo. Construímos um transgene no qual a sequência de codificação de Hoxd-4 tinha sido fundida à região promotora do gene Hoxa-1. Esta construção foi então integrada no genoma do rato. Em embriões de rato do tipo selvagem,Hoxd-4 é expresso até ao nível do quinto somito, que participa na formação do atlas (C1 na Fig. 2D). A colocação de Hoxd-4 sob o controlo de elementos reguladores cis-reguladores de Hoxa-1 conduz a sua expressão para um domínio anterior ectópico que abrange os quatro somitos occipitais, que normalmente se fundem para formar os ossos basi- e exoccipitais (B e E na Fig. 2D). Em “Hoxa-1 promotor-Hoxd-4″(Hoxd-4+) recém-nascidos transgénicos, os ossos exoccipitais são substituídos por uma a quatro estruturas ossificadas ectópicas (A1-A4) que se assemelham aos arcos neurais das vértebras, e o basioccipital, normalmente um osso plano, adquire uma forma cilíndrica que lembra um corpo vertebral (B* na Fig. 2E)(10). Assim,a expressão ectópica de Hoxd-4 leva a transformações homeóticas posteriores, à semelhança do ganho de mutações homeóticas do gene de função em Drosophila. Esta experiência também forneceu provas de que pelo menos parte da rede genética HOM/Hox foi cooptada para transmitir identidades morfológicas a estruturas segmentadas em grupos animais empregando estratégias de desenvolvimento radicalmente diferentes, e que algum aspecto da função genética foi conservado desde a divergência de artrópodes e cordas. Esta conservação filogenética da função é reforçada pela capacidade de resgatar mutações de perda de função no gene homeota Drosophila por meio de genes Hox . É também de notar que as malformações observadas em ratos que exprimem ectopicamente Hoxd-4 correspondem às características normais dos agnáticos, os vertebrados mais primitivos, que tinham vértebras occipitais em vez de ossos occipitais. Essa alteração na expressão de um único gene Hox é suficiente para induzir uma alteração atávica pode ajudar a compreender os eventos genéticos que têm sido instrumentais na evolução da forma dos actuais vertebrados dos mais primitivos (revisto emRef. 12).
Exemplos de transformações hométicas resultantes de mutações de perda de função e de ganho de função dos genes Hox.(A-C) Comparação entre um tipo selvagem (A) e fetos nulos Hoxa-2 (B e C) das estruturas esqueléticas presentes na região do ouvido médio à nascença. (A) e (B) correspondem a vistas laterais e (C) a uma vista medial. Note-se que o elemento ptergoquadrado (Q) representa uma característica reptiliana atávica. G e G* ossos selvagens e goniais mutantes, respectivamente (este osso mais tarde torna-se parte do maléolo adulto); I e I2, incúdios ortotópicos e ectópicos, respectivamente; M e M2, maléolos ortotópicos e ectópicos, respectivamente; MC e MC2, cartilagens ortotópicas e ectópicas de Meckel, respectivamente; Q, elemento pterigoquadrado; S, stapes; T e T2, ossos do tímpano ortotópico e ectópico, respectivamente (modificado de Rijli et al.(40).(D-F) Vista lateral da junção occipitocervical em ratos recém-nascidos. (D) Rato do tipo selvagem: os domínios de expressão anterior da vértebra e osso occipital de Hoxd-3 e de Hoxd-4 são indicados em amarelo e verde, respectivamente. (E) Rato transgénico “Hoxa-1 promotor-Hoxd-4 (Hoxd-4+)” expressando Hoxd-4 nos quatro somitos occipitais mostrando a transformação homótica posterior dos ossos exoccipitais (E) e basioccipitais(B) em arcos neurais ectópicos (A1-A4) e num elemento esquelético cilíndrico alterado (B*), respectivamente.(F) Rato nocturno Hoxd-3 mostrando a occipitalização do atlas (C1). A1-A4, arcos neurais ectópicos; AC1, arco anterior do atlas; B e B*, ossos basioccipitais normais e homeoticamente transformados, respectivamente; C, calvária; C1-C4, vértebras cervicais 1 a 4; E, osso exoccipital; O, cápsula ótica.
Até à data, foram também relatadas numerosas mutações com perda de função nos genes Hox dos mamíferos (revisto emRef. 13). A estratégia consiste na perturbação de genes alvo por recombinação homóloga. Em resumo, um alelo de tipo selvagem é substituído por um alelo não funcional no genoma de uma célula ES, que é depois injectado num blastocisto de rato para gerar uma quimera, do qual os animais mutantes são derivados através da transmissão da linha germinal da mutação. Durante os últimos anos, mais de metade dos genes Hox foram funcionalmente inactivados. Na maioria destes estudos, o fenótipo mutante nulo compreendeu pelo menos uma transformação vertebral, como por exemplo: “occipitalização” do atlas (por exemplo, inactivação de Hoxd-3; Fig. 2F)(14); transformação do eixo para uma identidade atlas evidenciada pela formação de um arco ventral ao nível da segunda vértebra cervical (por exemplo inactivação de Hoxb-4)(15); conversão da primeira vértebra lombar numa vértebra torácica, produzindo assim um 14º par de costelas supranumerário (por exemplo, inactivação de Hoxc-8)(16); transformação da primeira vértebra sacral numa vértebra lombar (por exemplo inactivação de Hoxd-11)(17, 18). É de notar que as transformações axiais correspondem quase sempre a anteriorizações de tal forma que a vértebra(e) transformada adquire a morfologia do seu vizinho anterior do tipo selvagem. Do mesmo modo, as mutações por perda de funções dos genes homeoticos na mosca da fruta levam a transformações homeoticas de segmentos do corpo a um destino anterior (ver acima). Além disso, ratos mutantes nulos para um dado gene Hox normalmente mostram transformações homeoéticas na região mais anteriormal onde esse gene Hox é normalmente expresso, e não nas regiões onde um gene mais 5′ é expresso.
P>Junto, os resultados das mutações de ganho e perda de função apoiam a noção de uma hierarquia da função do gene homeota tanto em ratos como em moscas: em geral, mais proteínas Hox e homeota de acção posterior são dominantes no que diz respeito à função em relação a mais proteínas de acção anterior. Este fenómeno, que tem sido denominado “domínio posterior” (ou “prevalência posterior”) em ratos e “supressão fenotípica” em moscas, sugere que o programa morfogenético a um determinado nível do eixo principal do corpo é ditado pelo mais posterior (i.e. a maioria 5′-localizada no aglomerado) Hox ou gene homético expresso a esse nível axial(revisto emRef. 6).
A recente análise dos mutantes Hox duplos e triplos levou a uma revisão parcial do modelo de “prevalência posterior” da função do gene Hox. Um aspecto quantitativo foi integrado no modelo(6), que tem em conta a possibilidade de que a duplicação em tandem e a tetraploidização dos genes Hox nos mamíferos possa ter resultado em funções parcialmente redundantes(18-22): que a inactivação de um único gene Hox resulta em transformações vertebrais apenas no seu domínio de expressão anteriormal pode reflectir o facto de ser quantitativamente preponderante nesta região; contudo, a interrupção simultânea de duas (ou mais) outras proteínas Hox expressas ao mesmo nível axial, mas presentes individualmente em quantidades menores, pode levar ao mesmo fenótipo. Portanto, a especificação vertebral é mais provavelmente alcançada pela cooperação funcional de uma “combinação” de genes Hox expressos a um dado nível axial (a Hox combinatória(23) em vez de pela função de um único gene.
Genes Hox na morfogénese de membros e padrões de trajectórias reprodutivas e digestivas. A família de genes Hox de mamíferos contém 15 genes relacionados com o gene Drosophila, Abd-B(Fig. 1). Para além dos seus domínios de expressão ao longo da coluna vertebral, a maioria destes genes relacionados com Abd-B são expressos com domínios sobrepostos nos membros anteriores e posteriores em desenvolvimento, consistentes com um papel na especificação do padrão de dígitos(24). De facto, as experiências knock-out de genes murinos relacionados com o B- Abdominal resultaram em redução de tamanho, alterações na forma, e/ou ossificação retardada de elementos esqueléticos de ambos os membros dianteiros (por exemplo, Hoxd-9, Hoxd-9, Hoxd-11)(17, 21, 25, 26) e traseiros (por exemplo, Hoxa-10)(18). Estes resultados indicam que estes genes controlam inicialmente a atribuição e crescimento de condensações pré-condrogénicas e, subsequentemente, a sequência de ossificação dos modelos de cartilagem (revista emRef. 13). No entanto, nunca foram observadas transformações homeoéticas. Por exemplo, a perturbação do gene Hoxd-13, que é especificamente expressa no território dos presumíveis dígitos, resulta na truncagem da maioria dos ossos metacarpianos e metatarsais, encurtamento ou ausência de certas falanges, bem como a formação de um rudimento supranumerário de dígitos no membro anterior(27)(Fig. 3, A e B). A perturbação orientada do Hoxa-13 resultou num fenótipo autopodal, distinto do do seu paralogue Hoxd-13, incluindo a falta do primeiro dígito tanto nos membros anteriores como posteriores e alteração de alguns elementos carpal/tarsal, sugerindo que estes dois genes não são funcionalmente equivalentes para o desenvolvimento autopodal(28).
Exemplos de defeitos nos membros resultantes de perturbações do gene Hox. Vista dorsal do forelimb autopod (carpas, metacarpos, e falanges) em mutantes adultos do tipo selvagem (WT) e Hox (genótipos como indicado). Os dígitos são numerados em numerais romanos, sendo o dígito I(polegar) o mais anterior e o dígito V o mais posterior. (A) e (B) As anomalias mutantes Hoxd-13 incluem um osso supranumerário do carpo (o postminimo, pm) nos heterozigotos (d-13+/-) e um dígito supranumerário posxial, distal ao postminimo nos homozigotos (d-13-/-, seta); os homozigotos mutantes também apresentam tipicamente uma ausência da 2ª falange nos dígitos II e V. (C) Hox-13+/-/Hoxd-13-/- mutante composto mostrando polidactilia e deformações graves, truncagens e fusões de dígitos sob a forma de um arco “falangeal terminal”(`TA’). Note-se que os mutantes heterozigotos Hoxa-13 têm um esqueleto de autopodas quase normal, excepto para anomalias menores das falanges de dígitos I. I-V, dígitos de um a cinco; M, ossos metacarpianos; P1, P2, e P3, primeira, segunda, e terceira falanges respectivamente; pm, pós-minimo, R, raio; `TA’, arco falangeal terminal; U, ulna. (Modificado de Dolléet al.(27) e Fromental-Ramain et al.(28).
Por outro lado, os fenótipos compostos Hox mutantes também revelaram funções parcialmente redundantes na patterização dos membros, como para a especificação vertebral (ver acima), entre os genes parálgicos(28, 29) e não parálgicos(18). Por exemplo, os mutantes compostos Hoxa-13/Hoxd-13 revelaram alterações de crescimento e de padrões dos autopods muito mais severas do que as observadas em cada mutante (ou seja, falta quase completa de padrões condrogénicos;Fig. 3, A-C) mostrando que estes produtos genéticos também se podem compensar parcialmente(28).
Duas anomalias de membros humanos herdados foram recentemente descritas, causadas por mutações nos genes HOXD13 e HOXA13(30, 31). Sinpolidactly humano é uma síndrome semidominante e resulta da inserção na estrutura de estiramentos curtos de poli(alanina) na região N-terminal do HOXD13(30). Intrigantemente, o fenótipo do membro humano é mais grave (tanto no estado homozigoto como heterozigoto) do que o fenótipo de perturbação do gene Hoxd-13 em ratos(27) (Fig. 3, A e B). Por outro lado, as anomalias dos membros sinpolidactamente semelhantes às observadas nos mutantes compostos Hoxa-13/Hoxd-13(28)(Fig. 3C). Uma explicação molecular plausível é que a proteína humana mutante é transcritivamente inactiva, mantendo ao mesmo tempo todas as suas propriedades de ligação ao ADN, apresentando assim propriedades negativas dominantes. Através da ocupação do local de ligação, pode interferir com as funções de outras homeoproteínas normalmente envolvidas na morfogénese dos dígitos, como por exemplo HOXA13, levando a alterações mais severas do que as devidas apenas à inactivação de Hoxd-13(28, 32). A síndrome mão-pé-genital humana é uma síndrome autossómica dominante devido a uma mutação sem sentido no homeodomínio HOXA13(31), que afecta principalmente o primeiro dígito (tanto o polegar como o dedo grande do pé), bem como o desenvolvimento do canal de Müllerian, ureteral e uretral (causando o útero didélfico ou bicornato, aberturas ureterais ectópicas e hipospadias). Que os heterozigotos para a mutação nula do Hoxa-13 no rato mostram defeitos aparentemente menos graves do que os observados na síndrome mão-pé-genital apoia a sugestão anterior de que a mutação HOXA-13 resulta numa proteína que exerce um efeito negativo dominante(31) (X. Warot, C. Fromental-Ramain, P. Chambon, e P. Dollé, observações não publicadas).
Estudos transversais revelaram papéis para outros genes Hox relacionados com Abd-B no desenvolvimento do tracto geniturinário e na parte terminal do tracto digestivo. Tanto o macho como a fêmea Hoxa-10 mutantes nulos são hipoférteis. Os sujeitos masculinos mutantes apresentam criptorquidismo, causado pela formação anormal do canal inguinal e por uma falha no encurtamento do gubernaculum(33, 34). Além disso, exibem uma malformação do canal deferente que se assemelha a uma transformação homótica parcial em epidídimo(35). A homeose parcial do canal deferente a uma morfologia semelhante à epidídima é também observada em Hoxa-11 mutantes nulos(36). Curiosamente, as fêmeas nulas mutantes Hoxa-10 apresentam uma transformação anterior a um nível correspondente do aparelho reprodutivo, porque a parte proximal do útero é transformada numa estrutura semelhante a um oviduto(35). Estes dados indicam claramente uma função importante de alguns genes Hox na definição dos destinos regionais ao longo do eixo anteroposterior dos ductos Wolffian e Müllerian.
Os genes murinos mais “posteriores”, Hoxd-12 e Hoxd-13, foram também encontrados com uma função específica na morfogénese da parte terminal do tracto digestivo. De facto, os mutantes nulos Hoxd-12 e Hoxd-13 apresentam uma desorganização das camadas musculares lisas formando o esfíncter anal interno, resultando em prolapsos rectos em alguns mutantes(37).
Genes Hox em patterização do cérebro traseiro e desenvolvimento craniofacial. O rombencéfalo ou rombencéfalo, está transitoriamente dividido ao longo do seu eixo anteroposterior numa série de segmentos (sete em ratos e homem) chamados rhombomeres(38). Esta organização segmentar do rombencéfalo determina a migração segmentar do NCC a partir do neurectoderme para povoar e modelar os arcos faríngeos. As análises de hibridação in situ revelaram que, em geral, parte da combinação do gene Hox expresso num dado rhombomere é também expressa no NCC migrando a partir desse rhombomere, sugerindo que os genes Hox podem ser instrumentais na padrões da região ramial da cabeça (revisto emRef. 39).
Para validar esta hipótese, nós e outros inactivámos funcionalmente o gene Hoxa-2(40, 41). NCC emigrando dos dois primeiros rhombomeres e mesencéfalo caudal normalmente povoam o primeiro arco (ou maxilomandibular) onde dão origem aos ossos dentários, maxila, esquamosal, tímpano, maléolo, e incus e à cartilagem de Meckel. Os CCN provenientes do quarto rhombomere normalmente povoam o segundo arco (ou hióide) e formam o estribo, osso estilóide, e o corno inferior do osso hióide. Hoxa-2 é o gene “anteriormost” Hox, pois é o único membro desta família a ser expresso no segundo rhombomere. Contudo, a este nível do eixo anteroposteior, a sua expressão restringe-se ao neurectoderme; assim, o NCC do primeiro arco faríngeo não exprime qualquer gene Hox. Em contraste, o Hoxa-2 é expresso no NCC do segundo arco faríngeo. No Hoxa-2 fetos nulos, o esqueleto derivado do NCC do segundo arco faríngeo está selectivamente em falta (por exemplo, o estribo, Fig. 2, A-C). No lugar dos elementos esqueléticos do segundo arco, está presente um conjunto caudal ectópico de elementos esqueléticos do primeiro arco, principalmente como uma imagem espelho do seu homólogo ortotópico. Este conjunto ectópico compreende: 1) dentro da região do ouvido médio, uma incisão supranumerária, maléolo, cartilagem de Meckel truncada, e osso timpânico (Fig. 2, A-C); 2) fora da região do ouvido médio, um pequeno osso esquelético supranumerário(40). Estes dados da análise esquelética, combinados com dados de expressão genética, indicam que a perturbação do gene Hoxa-2 resulta numa transformação homótica da identidade do segundo para o primeiro arco faríngeo. Tal transformação revela que o programa morfogenético do NCC derivado dos dois primeiros rômbones corresponde a um programa de padrões (ou padrão) esqueletogénicos (GPP) que é comum ao NCC mesenquimal de pelo menos o primeiro e segundo arcos faríngeos, e não requer a expressão do gene Hoxa-2. Em ratos do tipo selvagem, o GPP é respeitado pelo Hoxa-2, que, tal como os genes homóticos Drosophila, actua como um gene selector para produzir o segundo programa morfogenético específico do arco. Curiosamente, uma estrutura esquelética atávica correspondente ao maxilar superior reptiliano (ou pterygoquadrate) da cartilagem é desenvolvida a partir do segundo arco de mutantes Hoxa-2 (Fig. 2C); assim, na ausência deste gene, o segundo arco NCC parece executar um GPP que corresponde ao da fase terapêutica da evolução dos mamíferos(12, 40).
Estudos de inactivação adicional também suportaram papéis importantes dos genes Hox em patterning hindbrain e arcos faríngeos. Por exemplo, a inactivação direccionada de Hoxa-3 leva ao hipoparatiroidismo e à hipoplasia tímica e tiroidiana(42). Curiosamente, estes defeitos são também observados na síndrome de Di George (que, contudo, não é devida a uma mutação do gene Hox) . Defeitos de rhombomeres 4 e 5, anomalias do nervo craniano e do ouvido interno foram encontrados em Hoxa-1 mutantes nulos(44, 45), e deficiências selectivas do núcleo motor do nervo facial foram observadas em ratos nocturnos Hoxb-1 e Hoxb-2(46-48). Características destes fenótipos, tais como a paralisia dos músculos faciais, assemelham-se às da paralisia de Bell e síndromes de Moebius em humanos.