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Har Gobind Khorana nasceu de pais hindus em Raipur, uma pequena aldeia em Punjab, que faz agora parte do Paquistão oriental. A data correcta do seu nascimento não é conhecida; a data indicada em documentos é 9 de Janeiro de 1922. Ele é o mais novo de uma família de uma filha e quatro filhos. O seu pai era um “patwari”, um funcionário de impostos agrícolas da aldeia no sistema de governo britânico indiano. Embora pobre, o seu pai dedicou-se à educação dos seus filhos e eles eram praticamente a única família alfabetizada da aldeia habitada por cerca de 100 pessoas.
Har Gobind Khorana frequentou a Escola Secundária D.A.V. em Multan (agora Punjab Ocidental); Ratan Lal, um dos seus professores, influenciou-o muito durante esse período. Mais tarde, estudou na Universidade de Punjab em Lahore, onde obteve o grau de M. Sc. Mahan Singh, um grande professor e preciso experimentalista, foi seu supervisor.
Khorana viveu na Índia até 1945, quando a atribuição de uma bolsa de estudo do Governo da Índia lhe permitiu ir para Inglaterra e estudou para um doutoramento na Universidade de Liverpool. Roger J. S. Beer supervisionava a sua investigação e, além disso, cuidava dele diligentemente. Foi a introdução de Khorana à civilização e cultura ocidentais.
Khorana passou um ano de pós-doutoramento (1948-1949) na Eidgenössische Technische Hochschule em Zurique com o Professor Vladimir Prelog. A associação com o Professor Prelog moldou imensamente o seu pensamento e filosofia para a ciência, trabalho e esforço.
Após um breve período na Índia no Outono de 1949, Khorana regressou a Inglaterra onde obteve uma bolsa de estudo para trabalhar com o Dr. (agora Professor) G. W. Kenner e o Professor (agora Senhor) A. R. Todd. Esteve em Cambridge de 1950 a 1952. Mais uma vez, esta estadia provou ser de valor decisivo para Khorana. O interesse em proteínas e ácidos nucleicos criou raízes nessa altura.
Uma oferta de emprego em 1952 do Dr. Gordon M. Shrum da Columbia Britânica (agora Chanceler da Universidade Simon Fraser, Columbia Britânica) levou-o a Vancouver. O British Columbia Research Council ofereceu nessa altura muito pouco em termos de instalações, mas havia “toda a liberdade do mundo”, para usar as palavras do Dr. Shrum, para fazer o que o investigador gostava de fazer. Durante os anos seguintes, com a inspiração e encorajamento do Dr. Shrum e a ajuda frequente e aconselhamento científico do Dr. Jack Campbell (agora Chefe do Departamento de Microbiologia da Universidade de British Columbia), um grupo começou a trabalhar no campo dos ésteres de fosfato e ácidos nucleicos biologicamente interessantes. Entre os muitos colegas dedicados e leais deste período, deve ser mencionado, em particular, o Dr. Gordon M. Tener (actualmente Professor no Departamento de Bioquímica da Universidade de British Columbia), que muito contribuiu para o bem-estar espiritual e intelectual do grupo.
Em 1960 Khorana mudou-se para o Instituto de Investigação Enzimática da Universidade de Wisconsin. Tornou-se um cidadão naturalizado dos Estados Unidos. A partir do Outono de 1970 Khorana foi Alfred P. Sloan Professor de Biologia e Química no Massachusetts Institute of Technology.
Har Gobind Khorana foi casado em 1952 com Esther Elizabeth Sibler, que é de origem suíça. Esther trouxe um consistente sentido de propósito à sua vida, numa altura em que, após seis anos de ausência do país onde nasceu, Khorana se sentia deslocado em todo o lado e em casa, em lado nenhum. Eles têm três filhos: Julia Elizabeth (nascida a 4 de Maio de 1953), Emily Anne (nascida a 18 de Outubro de 1954), e Dave Roy (nascido a 26 de Julho de 1958).