Viroides: Definição e Características

Fundo

Viroides foram descobertos pelo Dr. Theodor Diener enquanto se esforçava por identificar a causa de uma doença do fuso do tubérculo da batata. Em primeira instância, acreditava-se que a doença era causada por um vírus. As experiências concebidas para identificar o hipotético vírus produziram resultados inesperados. As observações revelaram que a maioria dos agentes infecciosos presentes em extractos de plantas doentes não sedimentaram uma pastilha quando submetidos a uma força centrífuga suficiente para sedimentar todos os vírus conhecidos. A centrifugação por gradiente de densidade e a electroforese em gel de poliacrilamida confirmaram que o agente infeccioso era uma partícula não convencional. Esta partícula peculiar era sensível ao tratamento com ribonuclease (sem infecciosidade) e insensível aos tratamentos com desoxirribonuclease, fenol, clorofórmio, n-butanol ou etanol. Em 1967 torna-se evidente que o agente da doença do fuso da batata não era um vírus, pelo que o termo “viroide” foi proposto para este RNA infeccioso livre.

Viroides são parasitas restritos a plantas que podem levar a condições que causam perdas significativas nas culturas. Os viróides consistem em RNA monofilamento, circular e de baixo peso molecular (246-496 nt), não possuem uma casca de proteína ou membrana, contudo, e dada a sua complexa estrutura secundária, têm propriedades invulgares tais como resistência à digestão por ribonuclease e desnaturação. As viróides não codificam nenhuma proteína para fornecer funções específicas, o seu mecanismo de infecção sistémica baseia-se na sequenciação da maquinaria de síntese do ácido nucleico da célula hospedeira e na interacção com factores genéticos hospedeiros, e na replicação autónoma por mecanismos de replicação em círculo rolante (as taxas de replicação podem exceder as taxas de degradação).

Os intermediários de replicação envolvem dsRNA e são processados em três etapas básicas: a síntese de cadeias longas (múltiplas unidades) mediadas por polimerases de RNA do hospedeiro, que são depois processadas a monómeros e finalmente ligadas em unidades circulares Referência. As questões mais intrigantes que permanecem em relação às doenças virais são:1) como se replicam autonomamente nas plantas hospedeiras (base molecular da gama de hospedeiros viroides) evitando-se mecanismos de defesa contra a infecção, 2) como os viroides se propagam sistemicamente (que factores hospedeiros participam em etapas específicas do ciclo de replicação e tráfico) e 3) como os viroides causam sintomas de doença (quais são os alvos dos determinantes da patogenicidade viroideana) sem codificar proteínas.

Esquema de Classificação

Análises comparativas das estruturas primária e secundária permitiram a classificação dos viroides em duas famílias; estas famílias apresentam diferenças significativas nas suas estruturas secundárias, vias de replicação, e localização subcelular

Família Pospiviroidae (a maioria dos viroides) é uma sigla derivada do viróide do fuso do tubérculo da batata, o tipo representativo da espécie. Os viroides que pertencem a esta família adoptam uma estrutura secundária de quase-roda ou de vara, com regiões dsRNA separadas por laços internos de cadeia única não emparelhados, nos quais cinco domínios estruturais podem ser distinguidos (referência). A Região Conservada Central (CCR) que contém sítios conservados entre espécies do mesmo género, e desempenha um papel na replicação/processamento do viróide, os domínios terminais esquerdo e direito (TL, TR) relacionados com a duplicação e movimento do viróide, o domínio variável (V) que é o mais diferente entre espécies de viroides do mesmo género, e o domínio de patogenicidade (P) que contém elementos estruturais que contribuem substancialmente para a regulação da expressão dos sintomas

Com estes domínios, há três que são conservados entre as espécies: 1) CCR, formado por duas séries opostas de nucleótidos que são ladeadas por sequências invertidas repetidas (o ramo inferior e superior), 2) Região Conservada Terminal (TCR), localizada no ramo superior do domínio terminal esquerdo, e 3) Gancho de Cabelo Conservado Terminal (TCH), que também está localizado no domínio terminal esquerdo. A sequência do CCR, e a presença ou ausência de TCR e TCH (ambas as regiões não coexistem simultaneamente) serviram para agrupar as espécies viroideas desta família em cinco géneros (o tipo de CCR serve para definir o género). As espécies são definidas principalmente com base na sua estrutura primária. Um nível arbitrário de 90% de identidade de sequência é aceite para separar as espécies das estirpes

família Avsunviroidae. Os três motivos conservados acima mencionados não estão presentes em quatro espécies de viroides que pertencem à segunda família denominada Avsunviroidae, que tem o nome da espécie tipo, ASBVd. A classificação desta espécie baseia-se na composição G+ C e nas previsões de estrutura secundária, na morfologia da ribozima de cabeça de martelo (HHRz) e na base da insolubilidade do LiCl. Estas espécies exibem a propriedade de que os filamentos de ambas as polaridades podem sofrer clivagem automática por ribozimas de cabeça de martelo, e ainda, duas delas (ASBVd, PLMVd) adoptam estruturas secundárias ramificadas e elementos de estrutura terciária que ajudam a estabilizar a estrutura.

A classificação dos viroides em duas famílias é também um endosso importante de outra perspectiva que está ligada à replicação. Os membros da família Pospiviroidae replicam-se e acumulam-se no núcleo e no nucléolo seguindo um mecanismo de círculo de rolamento assimétrico, e as enzimas hospedeiras que poderiam estar envolvidas na replicação dos membros desta família são enzimas com actividade nucléica especificamente membros da família RNase III, uma enzima diferente da única ligase caracterizada nas plantas, e a DNA polimerase II dependente do RNA; enquanto os membros da família Avsunviroidae replicam-se e acumulam-se no cloroplasto e a replicação prossegue através de um mecanismo de círculo de rotação simétrico utilizando um plastidor codificado com núcleo (NEP)-como a RNA polimerase, actuam como ribozimas auto-catalizadoras realizadas por motivos de cabeça de martelo contidos em fios de ambas as polaridades, e foram postulados para também possuírem a propriedade de auto-ligação

A base de dados Subviral RNA (http://subviral.med.uottawa.ca/cgi-bin/home.cgi ) contém informação actualizada e possui uma compilação disponível de quarenta e três genomas completos para viroides, dos quais são relatadas 4700 sequências de variantes. A família Pospiviroidae é representada por vinte e sete espécies e a família Avsunviroidae por quatro espécies; várias outras espécies não foram classificadas.

Análise do Genoma Funcional

Tamanho do genoma viroide varia entre 246-491 nucleótidos, mas apesar do seu genoma mínimo e sem capacidade de codificação, eles modulam a replicação e dirigem o seu movimento intracelular, intercelular e de longa distância. Também se reconhece que activam os mecanismos de defesa da planta e que na maioria dos casos estes mecanismos de defesa são insuficientes para evitar a expressão de sintomas. A molécula de RNA viroide tem muitas funções biológicas associadas condensadas na sua curta sequência e, sem codificar proteínas, o genoma de um viroide deve expressar directamente as funções biológicas. Estudos anteriores mostraram que quase todos os nucleótidos são funcionais e estão sob selecção natural. Avanços significativos na compreensão das relações entre viróide e hospedeiro resultarão de uma dissecação abrangente da função dos motivos do genoma viróide, e na compreensão de como interagem com determinados factores celulares.

3.1. Pospiviroidae: Domínios conservados, motivos de sequência, e ganchos de cabelo

Como discutido anteriormente, as espécies do tipo Pospiviroidae adoptam uma estrutura secundária tipo vara. A estrutura secundária tornou-se evidente depois de a estirpe intermédia PSTVd (PSTVd-DI) ter sido sequenciada, por previsões termodinâmicas, e por microscopia electrónica. Mais tarde, esta estrutura tipo vara foi proposta para a maioria das espécies de Pospiviroidae. A presença de cinco domínios estruturais foi revelada através da análise comparativa da sequência.

TR, TL.- Estes domínios são permutáveis entre viroides e podem desempenhar um papel nos rearranjos de RNA durante a evolução do viroide. Estes domínios estão também envolvidos no movimento viroide em plantas ; .

TL.- A extremidade esquerda da maioria das espécies de Pospiviroide e Apscaviroid contém uma repetição imperfeita; em PSTVd as respectivas sequências são de nt 341-358 e de nt 2-21. Cada repetição é um palíndromo imperfeito que permite a formação de uma estrutura em forma de vara ou em Y. O viróide de Iresine (IrVd) não tem esta sequência de repetição, foi proposto que este viróide poderia ter tido origem pela eliminação de uma das repetições nesta região de um viróide ancestral. Por mutagénese dirigida ao local e inoculação mediada por Agrobacterium, foram determinadas correlações desta região com os primeiros passos da transcrição (.

P (Patogenicidade).- Esta região tem um trecho de oligopurina no cordão superior e o correspondente trecho de oligopropiridina no cordão inferior dos mais pospiviroides. Este emparelhamento resultante constitui uma região estrutural que tem baixa estabilidade termodinâmica. Após a sequência de variantes de patogenicidade PSTVd, apenas ligeiras variações na sequência nesta região foram associadas à expressão dos sintomas, e a esta região foi dado o nome de VMR (Região Moduladora da Virulência). Este domínio está associado à expressão dos sintomas e caracterizado por uma sequência de oligo (A5-6). A patogenicidade viróide tem sido analisada há muito tempo no que diz respeito à estrutura única de alta base do RNA genómico. As mudanças de sequência localizadas dentro deste domínio têm efeitos dramáticos na expressão dos sintomas PSTVd ( . No entanto, as mudanças nos outros quatro domínios estruturais podem também ter efeitos significativos no desenvolvimento dos sintomas . Apenas 40 dos 359 nucleótidos do genoma PSTVd representam a região de modulação da patogenicidade. Os segmentos dos 40-60 nt no cordão superior e 200-321 nt no cordão inferior, constituem uma região parcialmente de duplo cordão. A ligação da proteína quinase activada pelo dsRNA (PKR) à região P foi descoberta anteriormente como um evento patogénico primário. Contudo, trabalhos subsequentes revelaram um cenário mais complexo controlado por outros determinantes nos cinco domínios.

CCR.- É a região mais altamente conservada entre os viroides. Este domínio central conservado é formado por dois trechos de nucleótidos conservados nos cordões superior e inferior ladeados por uma repetição invertida imperfeita no cordão superior. Este domínio é crucial para o mecanismo proposto para replicação e processamento de transcrições de PSTVd (+) RNA mais longas do que o comprimento da unidade. A estrutura responsável pelo processamento é uma estrutura de quatro camadas com um sítio de clivagem/ligação entre nucleótidos G95 e G96 .

V (Variável).- Como região mais variável, esta região tem a maior variabilidade de sequência entre os viroides estreitamente relacionados. Contém uma caixa G:C com um mínimo de três pares G:C com função ainda desconhecida. Os limites do domínio V foram definidos por uma mudança da homologia de sequência baixa para os domínios C e TR adjacentes.

TR.- A duplicação de sequência da extremidade terminal direita na variante CCCVd mais pequena dá origem a moléculas mais longas; estas moléculas existem em formas diméricas e circulares. Um pequeno motivo purina/pirimidina neste domínio, que é conservado em todos os membros do género Pospiviroid, foi proposto para mediar o transporte sistémico. A partir de curvas de fusão óptica e estudos cinéticos, concluiu-se que os viroides desnaturam a temperaturas elevadas não fisiológicas numa transição altamente cooperativa devido à dissociação da estrutura nativa em forma de vara que permite a formação de estruturas ramificadas estáveis. Estes ganchos estáveis não fazem parte da estrutura tipo vara.

Loop E.- No centro do CCR localiza-se um determinado laço interno (98-102, 256-261 PSTVd). Este laço mostra a homologia do laço E do RNA 5S da eucariótica. A irradiação UV directa das folhas de tomate infectadas com PSTV e a análise do RNA mostrou que o laço E também é formado in vivo. Na estrutura de processamento, o ponto de clivagem está localizado perto de um tetraloop contendo a sequência filogenética conservada -GAAA- que também faz parte do loop E.

O domínio de processamento Loop E edita o processamento do viroide, com um RNA de 148 nucleótidos linear cobrindo o núcleo do domínio CCR e incluindo uma duplicação de 17 nucleótidos do cordão superior. As mutações localizadas dentro deste motivo alteram a especificidade do hospedeiro ou a patogenicidade do viroide. Este motivo está envolvido nas interacções RNA-RNA e RNA-proteína e encontra-se numa vasta gama de RNAs na natureza. Os sítios de clivagem na estrutura produzem dois nucleótidos de 3′- em cada filamento. Os RNAs de classe III mostram uma clara preferência por substratos com uma estrutura secundária compacta. As transcrições monoméricas (+) do CEVd que se acumulam em Arabidopsis thaliana têm estes termini (Gas, et al. 2008). As provas in vitro da sua relação com o processo de ligação viroide durante a replicação foram derivadas da incubação de PSTVd (+) RNA com uma curta repetição do fio superior do CCR. Devido à presença da forma circular, foi proposto que a clivagem enzimática e a ligadura resultam da sequência conservada – GAAA- (Baumstark, et al. 1997). Notavelmente, o motivo Loop E também pode estar envolvido na patogenicidade viroide de especificidade do hospedeiro (Qi e Ding, 2003), e na acumulação de descendentes (Zhong, et al. 2006). Foi reconhecido que este laço faz parte do sítio de ligação de duas proteínas: o factor de transcrição IIIA que activa a transcrição do rRNA 5S, e a proteína ribossómica L5 associada ao processamento pós-transcrição do RNA desde o nucleoplasma até ao nucleolus. Dados recentes mostraram que L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana ligam PSTVd (+) RNA com a mesma afinidade que ligam o seu RNA 5S, enquanto que a afinidade do RNA do viróide cloroplástico é menor (Eiras, et al. 2011); contudo, o laço E não é conservado em todos os membros Pospiviroidae e resta determinar se elementos alternativos têm função semelhante.

Hairpin I.- Nos pós-piviroides, hostuviroides e cocadviroides, o fio superior do CCR é capaz de formar um grampo capilar termodinamicamente estável de nove pares de base chamados Hairpin I. O grampo capilar I tem 14-15 nucleótidos e é uma sequência palíndroma. Os resultados obtidos num sistema in vivo utilizando linhas thaliana de Arabidopsis expressando transcrições diméricas do CEVd revelaram que o local de clivagem dos fios (+) está no CCR superior (Daros e Flores 2004a; Gas, et al. 2007)numa posição homóloga à do PSTVd (Baumstark, et al. 1997). Esta sequência conservada tem estado adicionalmente envolvida na importação de PSTVd para o núcleo (Abraitiene, et al. 2008; Zhao, et al. 2001).

Hairpin II.- Este motivo está localizado dentro do domínio V e TL. A hélice tem um comprimento de 11-12 nucleótidos e a sua composição é rica em conteúdo de G-C. Esta estrutura está ausente no CCCVd (Hadidi 2003). A mutagénese do PSTVd dirigida ao local mostrou que este motivo é crítico para a infecciosidade e actua como elemento funcional de (-) intermediários de replicação de fios (Loss, et al. 1991; Qu, et al. 1993). A sua relevância funcional baseia-se no seu papel crítico na infecciosidade e é altamente conservada entre os Pospiviroidae. O motivo do alfinete capilar II é adoptado por uma dobragem sequencial de (-) intermediários de fios, e é essencial para a sua actividade modelo em (+) síntese de fios durante eventos de replicação (Candresse, et al. 2001).

Hairpin III.- Este grampo capilar só foi encontrado em PSTVd (Henco, et al. 1979), e um motivo do grampo capilar IV foi identificado em CLVd (Owens, et al. 2003), no entanto, os seus papéis funcionais permanecem desconhecidos.

3.2. Avsunviroidae: Determinantes da patogenicidade, Ribozymes Hammerhead, e elementos de estrutura elevada

ASBVd foi inicialmente proposto dobrar para uma conformação alongada (Symons 1981), no entanto, relatórios posteriores mostraram que o domínio terminal esquerdo é bifurcado (Gast, et al. 1996). Outras espécies de viroides pertencentes a esta família também mostraram conformações estáveis e previsíveis multibranqueadas e provas deste tipo de conformações in vivo (Ambros, et al. 1998; Ambros, et al. 1999; Pelchat, et al. 2000; Rodio, et al. 2006; Yazarlou, et al. 2012). As espécies do género avsunviroid não partilham uma semelhança notável de sequências com o género Pelamoviroid; apenas as sequências conservadas do HHRz são partilhadas. ASBVd é um viróide único com um conteúdo G-C de apenas ~38% enquanto que o conteúdo G-C de PLMVd é superior a 52% (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).

Patogenicidade determinantes.- Usando a genética inversa foi demonstrado que a natureza da sequência tetraloop (que fecha o caule formado entre os nucleótidos 62 e 100) determina a expressão sintomática do CChMVd. O tetraloop (GAAA) conhecido como um determinante assintomático e o tetraloop (UUUC) reconhecido como efeito sintomático representam os dois principais exemplos. A análise de uma população de clones de cDNAs mostrou que as estirpes sintomáticas têm uma inserção de 12-13 nucleótidos em comparação com as assintomáticas. O laço de nucleótidos que fecha os hélices I e II estão localizados fora do HHR e contribuem sob selecção para uma emenda mais rápida do RNA para permitir uma auto-cleavagem catalítica eficiente.

Hammerhead Ribozymes.-A actividade catalítica destes RNAs reside na capacidade das suas duas vertentes de polaridade de se dobrarem em estruturas de cabeça de martelo, que facilitam a divisão de uma ligação específica de fosfodiester através de transesterificação que produz 5′- hydroxyl e 2′,2′ cyclic phosphodiester termini (Hutchins, et al. 1986; Prody, et al. 1986). Os HHRzs promovem a autoexcisão em cadeias de comprimento unitário dos intermediários multiméricos ES (Flores, et al. 2001). Estes ribozymes formam, em vez de serem compostos por, um núcleo central conservado flanqueado com três hélices de fio duplo (I, II e III), normalmente limitados por laços curtos (1, 2,3), assemelhando-se a um Y em que os hélices II e III são praticamente colineares (Martick e Scott 2006).

Estudos anteriores previstos pela análise in vitro e in vivo confirmaram o contacto físico entre os loops 1 e 2 e mostraram que esta interacção é crítica a baixos níveis fisiológicos de Mg2+ (De la Pena et al.., 2003; Khvorova et al., 2003). Não se sabe se a etapa de ligadura é também mediada in vivo por estes motivos. As provas in vitro mostraram que eles têm a capacidade de realizar esta reacção (Przybilski, et al. 2005; Przybilski e Hammann 2007a; Przybilski e Hammann 2007b).

Elementos de estrutura elevada.- As co-variações entre os ganchos capilares da estrutura secundária mais estável para a sequência PLMVd têm uma potencial interacção de pares de bases entre estes dois ganchos capilares, sugerindo a adopção pelo menos em algumas variantes de interacções de ganchos capilares (Ambros e Flores 1998; Ambros, et al. 1998). A recente sondagem in vitro confirma esta interacção (Dube, et al. 2010). Abordagens semelhantes às do PSTVd, revelaram que outro elemento de estrutura terciária entre dois nucleótidos conservados está localizado na sequência da vertente PLMVd (+). Folhas infectadas com PLMVd irradiadas com UV confirmaram que este elemento de estrutura terciária existe in vivo (Hernandez, et al. 2006), mas o seu papel funcional permanece desconhecido. ELVd (+) forma linear monomérica tem o potencial de tráfico para o núcleo e subsequentemente para os plastídeos, onde a replicação ocorre, sugerindo que o tráfico poderia ser regulado por um motivo RNA restrito ao domínio terminal esquerdo de ELVd (Pallas, et al. 2012).