cromatografía en papel
El papel se suspende en un recipiente con una capa poco profunda de un disolvente adecuado o una mezcla de disolventes. Es importante que el nivel de disolvente esté por debajo de la línea con las manchas. El siguiente diagrama no muestra los detalles de cómo se suspende el papel porque hay demasiadas formas posibles de hacerlo y eso abarrota el diagrama. A veces, el papel se enrolla en un cilindro suelto y se sujeta con clips por arriba y por abajo. El cilindro se coloca en el fondo del recipiente.
La razón para cubrir el recipiente es asegurarse de que la atmósfera del vaso de precipitados está saturada de vapor de disolvente. Saturar la atmósfera del vaso de precipitados con vapor impide que el disolvente se evapore al subir por el papel.
A medida que el disolvente asciende lentamente por el papel, los diferentes componentes de las mezclas de tinta se desplazan a diferentes velocidades y las mezclas se separan en manchas de diferentes colores.
El diagrama muestra el aspecto que podría tener la plancha después de que el disolvente se haya desplazado casi hasta la parte superior.
Es bastante fácil ver en el cromatograma final que la pluma que escribió el mensaje contenía los mismos colorantes que la pluma 2. También se puede ver que el bolígrafo 1 contiene una mezcla de dos colorantes azules diferentes – uno de los cuales podría ser el mismo que el colorante único del bolígrafo 3.
Valores Rf
Algunos compuestos de una mezcla viajan casi tan lejos como lo hace el disolvente; otros se quedan mucho más cerca de la línea base. La distancia recorrida en relación con el disolvente es una constante para un compuesto concreto siempre que se mantenga constante todo lo demás: el tipo de papel y la composición exacta del disolvente, por ejemplo.
La distancia recorrida en relación con el disolvente se llama valor Rf. Para cada compuesto se puede calcular mediante la fórmula:
Por ejemplo, si un componente de una mezcla ha recorrido 9,6 cm desde la línea base mientras que el disolvente ha recorrido 12.0 cm, entonces el valor de Rf para ese componente es:
En el ejemplo que vimos con las distintas plumas, no era necesario medir los valores de Rf porque estás haciendo una comparación directa con sólo mirar el cromatograma.
Estás asumiendo que si tienes dos manchas en el cromatograma final que son del mismo color y han recorrido la misma distancia en el papel, lo más probable es que sean el mismo compuesto. Por supuesto, esto no es necesariamente cierto, ya que puede haber dos compuestos de colores similares con valores de Rf muy parecidos. Más adelante veremos cómo evitar este problema.
¿Y si las sustancias que te interesan son incoloras?
En algunos casos, es posible hacer visibles las manchas haciéndolas reaccionar con algo que produzca un producto coloreado. Un buen ejemplo de esto es en los cromatogramas producidos a partir de mezclas de aminoácidos.
Suponga que tiene una mezcla de aminoácidos y quiere averiguar qué aminoácidos concretos contiene la mezcla. Para simplificar, supondremos que sabe que la mezcla sólo puede contener cinco de los aminoácidos comunes.
Se coloca una pequeña gota de una solución de la mezcla en la línea base del papel, y se colocan pequeñas manchas similares de los aminoácidos conocidos a su lado. A continuación, se pone el papel en un disolvente adecuado y se deja que se desarrolle como antes. En el diagrama, la mezcla es M, y los aminoácidos conocidos están etiquetados del 1 al 5.
Se marca con lápiz la posición del frente del disolvente y se deja secar el cromatograma, que luego se rocía con una solución de ninhidrina. La ninhidrina reacciona con los aminoácidos para dar compuestos coloreados, principalmente de color marrón o púrpura.
El diagrama de la izquierda muestra el papel después de que el frente de disolvente haya llegado casi a la parte superior. Las manchas siguen siendo invisibles. El segundo diagrama muestra el aspecto que podría tener después de rociar con ninhidrina.
No es necesario medir los valores de Rf porque se pueden comparar fácilmente las manchas de la mezcla con las de los aminoácidos conocidos, tanto por sus posiciones como por sus colores.
En este ejemplo, la mezcla contiene los aminoácidos etiquetados como 1, 4 y 5.
¿Y qué pasaría si la mezcla contuviera otros aminoácidos distintos a los que hemos utilizado para comparar? Habría puntos en la mezcla que no coincidirían con los de los aminoácidos conocidos. Tendrías que volver a realizar el experimento utilizando otros aminoácidos para comparar.
La cromatografía de papel de dos vías
La cromatografía de papel de dos vías sortea el problema de separar sustancias que tienen valores Rf muy similares.
Voy a volver a hablar de compuestos coloreados porque es mucho más fácil ver lo que ocurre. Se puede hacer perfectamente con compuestos incoloros – ¡pero hay que usar bastante la imaginación en la explicación de lo que ocurre!
Esta vez se hace un cromatograma partiendo de una sola mancha de mezcla colocada hacia un extremo de la línea base. Se pone en un disolvente como antes y se deja hasta que el frente del disolvente se acerque a la parte superior del papel.
En el diagrama se marca con lápiz la posición del frente del disolvente antes de que el papel se seque. Se ha marcado como SF1 – el frente de disolvente para el primer disolvente. Vamos a utilizar dos disolventes diferentes.
Si te fijas bien, podrás ver que la gran mancha central del cromatograma es en parte azul y en parte verde. Dos colorantes de la mezcla tienen casi los mismos valores de Rf. Por supuesto, también podrían ser del mismo color, en cuyo caso no se podría saber si hay uno o más colorantes presentes en esa mancha.
Lo que hay que hacer ahora es esperar a que el papel se seque por completo, y luego girarlo 90º, y revelar el cromatograma de nuevo en un disolvente diferente.
Es muy poco probable que los dos puntos confusos tengan los mismos valores de Rf en el segundo disolvente que en el primero, por lo que los puntos se moverán en una cantidad diferente.
El siguiente diagrama muestra lo que podría ocurrir con los distintos puntos del cromatograma original. La posición del frente del segundo disolvente también está marcada.
No verías, por supuesto, estos puntos en sus posiciones originales y finales – ¡se han movido! El cromatograma final tendría este aspecto:
La cromatografía bidireccional ha separado completamente la mezcla en cuatro puntos distintos.
Si quieres identificar las manchas de la mezcla, obviamente no puedes hacerlo con sustancias de comparación en el mismo cromatograma como vimos antes con los ejemplos de plumas o aminoácidos. Acabarías con un lío de manchas sin sentido.
Sin embargo, puedes calcular los valores de Rf para cada una de las manchas en ambos disolventes, y luego compararlos con los valores que has medido para compuestos conocidos bajo exactamente las mismas condiciones.
¿Cómo funciona la cromatografía en papel?
Aunque la cromatografía en papel es sencilla de hacer, es bastante difícil de explicar en comparación con la cromatografía en capa fina. La explicación depende en cierta medida del tipo de disolvente que se utilice, y muchas fuentes pasan por alto el problema por completo. Si aún no lo has hecho, sería útil que leyeras la explicación de cómo funciona la cromatografía en capa fina (enlace más abajo). Eso me ahorrará muchas repeticiones y podré concentrarme en los problemas.