Viroides: Definición y características
Antecedentes
Los viroides fueron descubiertos por el Dr. Theodor Diener mientras se esforzaba por identificar la causa de una enfermedad del tubérculo fusiforme de la patata. En un primer momento, se creyó que la enfermedad estaba causada por un virus. Los experimentos diseñados para identificar el hipotético presunto virus arrojaron resultados inesperados. Las observaciones revelaron que la mayoría de los agentes infecciosos presentes en los extractos de las plantas enfermas no sedimentaban en un pellet cuando se les sometía a una fuerza centrífuga suficiente para sedimentar todos los virus conocidos. La centrifugación en gradiente de densidad y la electroforesis en gel de poliacrilamida confirmaron que el agente infeccioso era una partícula no convencional. Esta partícula peculiar era sensible al tratamiento con ribonucleasa (sin infectividad) e insensible a los tratamientos con desoxirribonucleasa, fenol, cloroformo, n-butanol o etanol. En 1967 se hizo evidente que el agente de la enfermedad del huso de la patata no era un virus, por lo que se propuso el término «viroide» para este ARN infeccioso libre.
Los viroides son parásitos restringidos a las plantas que pueden provocar condiciones que causen pérdidas significativas en los cultivos. Los viroides están formados por ARN monocatenario, circular y de bajo peso molecular (246-496 nt), sin embargo no poseen una envoltura proteica o de membrana, y dada su compleja estructura secundaria tienen propiedades inusuales como la resistencia a la digestión y desnaturalización por ribonucleas. Los viroides no codifican ninguna proteína que les proporcione funciones específicas, su mecanismo de infección sistémica se basa en el secuestro de la maquinaria de síntesis de ácidos nucleicos de la célula huésped y en la interacción con factores genéticos del huésped, y se replican de forma autónoma mediante mecanismos de replicación en círculo rodante (las tasas de replicación pueden superar las tasas de degradación).
Los intermediarios de la replicación implican al dsRNA y se procesan en tres pasos básicos: la síntesis de cadenas largas (unidades múltiples) mediada por las ARN polimerasas dependientes del ADN del huésped, que luego se procesan a monómeros y finalmente se ligan en unidades circulares Referencia. Las cuestiones más intrigantes que quedan por resolver en relación con las enfermedades causadas por viroides son:1) cómo se replican de forma autónoma en las plantas huésped (base molecular del rango de huéspedes de los viroides) evadiendo los mecanismos de defensa contra la infección, 2) cómo se propagan los viroides de forma sistémica (qué factores del huésped participan en pasos específicos del ciclo de replicación y del tráfico) y 3) cómo causan los viroides los síntomas de la enfermedad (cuáles son los objetivos de los determinantes de patogenicidad de los viroides) sin codificar proteínas.
Esquema de clasificación
Los análisis comparativos de las estructuras primarias y secundarias han permitido clasificar los viroides en dos familias; estas familias presentan diferencias significativas en sus estructuras secundarias, vías de replicación y localización subcelular
La familia Pospiviroidae (la mayoría de los viroides) es un acrónimo derivado del viroide del tubérculo fusiforme de la patata, el tipo de especie representativa. Los viroides que pertenecen a esta familia adoptan una estructura secundaria similar a la de una varilla, con regiones de ARNd separadas por bucles internos no apareados de una sola cadena, en los que se pueden distinguir cinco dominios estructurales (referencia). La región central conservada (CCR) que contiene sitios conservados entre especies del mismo género, y desempeña un papel en la replicación/procesamiento del viroide, los dominios terminales izquierdo y derecho (TL, TR) relacionados con la duplicación y el movimiento del viroide, el dominio variable (V) que es el más diferente entre las especies de viroides del mismo género, y el dominio de patogenicidad (P) que contiene elementos estructurales que contribuyen sustancialmente a la regulación de la expresión de los síntomas
Dentro de estos dominios, hay tres que se conservan entre las especies: 1) CCR, formado por dos series opuestas de nucleótidos que están flanqueadas por secuencias inversas repetidas (la rama inferior y la superior), 2) Región Conservada Terminal (TCR), situada en la rama superior del dominio terminal izquierdo, y 3) Horquilla Conservada Terminal (TCH), que también se encuentra en el dominio terminal izquierdo. La secuencia de la RCC, y la presencia o ausencia de TCR y TCH (ambas regiones no coexisten simultáneamente) sirvieron para agrupar las especies de viroides de esta familia en cinco géneros (el tipo de RCC sirve para definir el género). Las especies se definen principalmente en función de su estructura primaria. Se acepta un nivel arbitrario del 90% de identidad de secuencia para separar las especies de las cepas
Familia avsunviroidae. Los tres motivos conservados mencionados anteriormente no están presentes en cuatro especies de viroides que pertenecen a la segunda familia denominada Avsunviroidae, que recibe el nombre de la especie tipo, ASBVd. La clasificación de esta especie se basa en la composición de G+ C y en las predicciones de la estructura secundaria, en la morfología de la ribozima de cabeza de martillo (HHRz) y en la insolubilidad del LiCl. Estas especies exhiben la propiedad de que las hebras de ambas polaridades pueden someterse a la autodivisión por parte de las ribozimas de cabeza de martillo, y además, dos de ellas (ASBVd, PLMVd) adoptan estructuras secundarias ramificadas y elementos de estructura terciaria que ayudan a estabilizar la estructura.
La clasificación de los viroides en dos familias es también un respaldo importante desde otra perspectiva que está ligada a la replicación. Los miembros de la familia Pospiviroidae se replican y acumulan en el núcleo y en el nucléolo siguiendo un mecanismo de círculo rodante asimétrico, y las enzimas del huésped que podrían estar implicadas en la replicación de los miembros de esta familia son enzimas con actividad nucleasa, específicamente miembros de la familia RNasa III, una enzima diferente de la única ligasa caracterizada en plantas, y la ADN polimerasa dependiente de ARN II ; mientras que los miembros de la familia Avsunviroidae se replican y acumulan en el cloroplasto y la replicación procede a través de un mecanismo de círculo rodante simétrico utilizando una ARN polimerasa similar a la codificada en el núcleo del plástido (NEP), actúan como ribozimas autocatalizadoras realizadas por motivos de cabeza de martillo contenidos en hebras de ambas polaridades, y se ha postulado que también poseen la propiedad de autoligarse
La base de datos de ARN subviral (http://subviral.med.uottawa.ca/cgi-bin/home.cgi ) contiene información actualizada y dispone de una recopilación de cuarenta y tres genomas completos de viroides, de los que se reportan 4700 secuencias variantes. La familia Pospiviroidae está representada por veintisiete especies y la familia Avsunviroidae por cuatro especies; varias otras especies no han sido clasificadas.
Análisis del genoma funcional
Los tamaños de los genomas de los viroides oscilan entre 246-491 nucleótidos, pero a pesar de su mínimo genoma y su nula capacidad de codificación, modulan la replicación y dirigen su movimiento intracelular, intercelular y a larga distancia. También se reconoce que activan los mecanismos de defensa de la planta y que en la mayoría de los casos estos mecanismos de defensa son insuficientes para evitar la expresión de los síntomas. La molécula de ARN del viroide tiene muchas funciones biológicas asociadas diferentes condensadas en su corta secuencia y, sin codificar proteínas, el genoma de un viroide debe expresar funciones biológicas directamente. Estudios anteriores han demostrado que casi todos los nucleótidos son funcionales y están sometidos a la selección natural. Los avances significativos en la comprensión de las relaciones viroide-huésped serán el resultado de una disección exhaustiva de la función de los motivos del genoma de los viroides, y en la comprensión de cómo interactúan con factores celulares particulares.
3.1. Pospiviroidae: dominios conservados, motivos de secuencia y horquillas
Como se ha comentado anteriormente, las especies tipo Pospiviroidae adoptan una estructura secundaria en forma de varilla. La estructura secundaria se hizo evidente tras la secuenciación de la cepa intermedia del PSTVd (PSTVd-DI), por predicciones termodinámicas y por microscopía electrónica . Posteriormente se propuso esta estructura en forma de varilla para la mayoría de las especies de Pospiviroidae. La presencia de cinco dominios estructurales fue revelada al hacer un análisis comparativo de la secuencia.
TR, TL.- Estos dominios son intercambiables entre los viroides y pueden jugar un papel en los reordenamientos del ARN durante la evolución de los viroides. Estos dominios también están implicados en el movimiento de los viroides en las plantas ;
TL.- El extremo terminal izquierdo de la mayoría de las especies de Pospiviroides y Apscaviroides contiene una repetición imperfecta; en el PSTVd las secuencias respectivas son del nt 341-358 y del nt 2-21. Cada repetición es un palíndromo imperfecto que permite la formación de una estructura en forma de varilla o de Y. El viroide de la Iresina (IrVd) no tiene esta secuencia de repetición, se propuso que este viroide podría haberse originado por la supresión de una de las repeticiones en esta región de un viroide ancestral. Mediante mutagénesis dirigida al sitio e inoculación mediada por Agrobacterium, se determinaron las correlaciones de esta región con los primeros pasos de la transcripción (.
P (Patogenicidad).Esta región tiene un tramo de oligopurina en la cadena superior y el correspondiente tramo de oligopirimidina en la cadena inferior de la mayoría de los pospiviroides. Este emparejamiento resultante constituye una región estructural de baja estabilidad termodinámica. Tras la secuenciación de las variantes de patogenicidad del PSTVd, sólo ligeras variaciones en la secuencia de esta región se asociaron con la expresión de los síntomas, y esta región se denominó VMR (Virulence Modulating Region). Este dominio está asociado a la expresión de los síntomas y se caracteriza por una secuencia oligo (A5-6). La patogenicidad de los viroides se ha analizado durante mucho tiempo en relación con la estructura única altamente emparejada en bases del ARN genómico. Los cambios de secuencia localizados en este dominio tienen efectos dramáticos en la expresión de los síntomas del PSTVd ( . Sin embargo, los cambios en los otros cuatro dominios estructurales también pueden tener efectos significativos en el desarrollo de los síntomas . Sólo 40 de los 359 nucleótidos del genoma del PSTVd representan la región moduladora de la patogenicidad. Los segmentos de 40-60 nt en la cadena superior y 200-321 nt en la cadena inferior, constituyen una región parcialmente de doble cadena. La unión de la proteína quinasa activada por el dsRNA (PKR) a la región P se descubrió anteriormente como un evento patogénico primario. Sin embargo, trabajos posteriores desvelaron un escenario más complejo controlado por otros determinantes en los cinco dominios.
CCR.- Es la región más conservada entre los viroides. Este dominio central conservado está formado por dos tramos de nucleótidos conservados en las cadenas superior e inferior flanqueados por una repetición invertida imperfecta en la cadena superior. Este dominio es crucial para el mecanismo propuesto para la replicación y el procesamiento de los transcritos de ARN del PSTVd (+) de longitud superior a la unidad. La estructura responsable del procesamiento es una estructura de cuatro hélices con un sitio de escisión/ligación entre los nucleótidos G95 y G96.
V (Variable).-Como región más variable, esta región tiene la mayor variabilidad de secuencia entre viroides estrechamente relacionados. Contiene una caja G:C con un mínimo de tres pares G:C con función aún desconocida. Los límites del dominio V han sido definidos por un cambio de baja homología de secuencia con los dominios C y TR adyacentes.
TR.- La duplicación de la secuencia del extremo terminal derecho en la variante más pequeña de CCCVd da lugar a moléculas más largas; estas moléculas existen en formas diméricas y circulares. Se ha propuesto que un pequeño motivo de purina/pirimidina en este dominio, que se conserva en todos los miembros del género Pospiviroid, media el transporte sistémico. A partir de curvas ópticas de fusión y estudios cinéticos, se concluyó que los viroides se desnaturalizan a temperaturas altas no fisiológicas en una transición altamente cooperativa debido a la disociación de la estructura nativa en forma de varilla que permite la formación de estructuras ramificadas estables. Estas horquillas estables no forman parte de la estructura tipo varilla.
Bucle E.- En el centro de la RCC se encuentra un bucle interno particular (98-102, 256-261 PSTVd). Este bucle muestra homología con el bucle E del ARN 5S eucariótico. La irradiación UV directa de las hojas de tomate infectadas por el PSTVd y el análisis del ARN mostraron que el bucle E también se forma in vivo. En la estructura de procesamiento, el sitio de corte se localiza cerca de un tetraloop que contiene la secuencia filogenéticamente conservada -GAAA- que también forma parte del bucle E.
El dominio de procesamiento del bucle E edita el procesamiento del viroide, con un ARN lineal de 148 nucleótidos que cubre el núcleo del dominio CCR e incluye una duplicación de 17 nucleótidos de la cadena superior. Las mutaciones localizadas en este motivo alteran la especificidad del huésped o la patogenicidad del viroide. Este motivo está implicado en las interacciones ARN-ARN y ARN-proteína y se encuentra en una amplia gama de ARN en la naturaleza. Los sitios de corte en la estructura producen dos nucleótidos 3′- en cada cadena. Los ARN de clase III muestran una clara preferencia por sustratos con una estructura secundaria compacta. Los transcritos monoméricos CEVd (+) que se acumulan en Arabidopsis thaliana tienen estas terminaciones (Gas, et al. 2008). La evidencia in vitro de su relación con el proceso de ligadura del viroide durante la replicación se derivó de la incubación del ARN del PSTVd (+) con una repetición corta de la cadena superior del RCC. Debido a la presencia de la forma circular, se propuso que la escisión enzimática y la ligadura son resultado de la secuencia conservada -GAAA- (Baumstark, et al. 1997). Sorprendentemente, el motivo del bucle E también puede estar implicado en la patogenicidad de los viroides por especificidad de huésped (Qi y Ding, 2003), y en la acumulación de progenie (Zhong, et al. 2006). Se ha reconocido que este bucle forma parte del sitio de unión de dos proteínas: el factor de transcripción IIIA que activa la transcripción del ARNr 5S, y la proteína ribosómica L5 asociada al procesamiento post-transcripcional del ARN desde el nucleoplasma al nucleolo. Datos recientes mostraron que L5 y TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unen al ARN del PSTVd (+) con la misma afinidad que a su ARN 5S, mientras que la afinidad del ARN del viroide cloroplástico es menor (Eiras, et al. 2011); sin embargo, el bucle E no está conservado en todos los miembros de Pospiviroidae y queda por determinar si los elementos alternativos tienen una función similar.
La horquilla I.- En los pospiviroides, hostuviroides y cocadviroides, la hebra superior de la RCC es capaz de formar una horquilla termodinámicamente estable de nueve pares de bases denominada Horquilla I. El bucle de la horquilla I tiene 14-15 nucleótidos y es una secuencia palíndroma. Los resultados obtenidos en un sistema in vivo utilizando líneas de Arabidopsis thaliana que expresan transcritos diméricos de CEVd han revelado que el sitio de corte de las hebras (+) se encuentra en la RCC superior (Daros y Flores 2004a; Gas, et al. 2007)en una posición homóloga a la del PSTVd (Baumstark, et al. 1997). Esta secuencia conservada se ha implicado adicionalmente en la importación de PSTVd al núcleo (Abraitiene, et al. 2008; Zhao, et al. 2001).
Herramienta II.- Este motivo se localiza dentro del dominio V y TL. La hélice tiene una longitud de 11-12 nucleótidos y su composición es rica en contenido G-C. Esta estructura está ausente en CCCVd (Hadidi 2003). La mutagénesis dirigida al sitio del PSTVd demostró que este motivo es crítico para la infectividad y actúa como un elemento funcional de los intermediarios de replicación de la cadena (-) (Loss, et al. 1991; Qu, et al. 1993). Su relevancia funcional se basa en su papel crítico en la infectividad y está muy conservado entre los Pospiviroidae. El motivo de la horquilla II es adoptado por un plegado secuencial de los intermediarios de la hebra (-), y es esencial para su actividad de plantilla en la síntesis de la hebra (+) durante los eventos de replicación (Candresse, et al. 2001).
Hairpin III.- Esta horquilla sólo se ha encontrado en el PSTVd (Henco, et al. 1979), y se ha identificado un motivo de horquilla IV en el CLVd (Owens, et al. 2003), sin embargo, sus papeles funcionales siguen siendo desconocidos.
3.2. Avsunviroidae: Determinantes de patogenicidad, ribozimas de cabeza de martillo, y elementos de alta estructura
Inicialmente se propuso que el ASBVd se plegaba en una conformación alargada (Symons 1981), sin embargo, informes posteriores mostraron que el dominio izquierdo-terminal está bifurcado (Gast, et al. 1996). Otras especies de viroides pertenecientes a esta familia también han mostrado conformaciones estables predecibles multiramificadas y evidencias de este tipo de conformaciones in vivo (Ambros, et al. 1998; Ambros, et al. 1999; Pelchat, et al. 2000; Rodio, et al. 2006; Yazarlou, et al. 2012). Las especies del género avsunviroid no comparten una similitud de secuencia notable con el género Pelamoviroid; sólo se comparten las secuencias conservadas del HHRz. ASBVd es un viroide único con un contenido de G-C de sólo ~38% mientras que el contenido de G-C de PLMVd es superior al 52% (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).
Determinantes de patogenicidad. Utilizando la genética inversa se ha demostrado que la naturaleza de la secuencia del tetraloop (que cierra el tallo formado entre los nucleótidos 62 y 100) determina la expresión de los síntomas de CChMVd. El tetraloop (GAAA) conocido como determinante asintomático y el tetraloop (UUUC) reconocido como efector sintomático representan los dos principales ejemplos. El análisis de una población de clones de ADNc mostró que las cepas sintomáticas tienen una inserción de 12-13 nucleótidos en comparación con las asintomáticas. El bucle de nucleótidos que cierra las hélices I y II se localiza fuera de la HHR y contribuye bajo selección a un empalme más rápido del ARN para permitir una autodivisión catalítica eficiente.
Ribozimas de cabeza de martillo.La actividad catalítica de estos ARNs reside en la capacidad de sus dos hebras de polaridad para plegarse en estructuras de cabeza de martillo, que facilitan el desdoblamiento de un enlace fosfodiéster específico a través de la transesterificación que da lugar a los terminales fosfodiésteres 5′- hidroxilo y 2′,2′ cíclicos (Hutchins, et al. 1986; Prody, et al. 1986). Las HHRzs promueven la autoescisión en hebras de longitud unitaria de los intermediarios multiméricos ES (Flores, et al. 2001). Estas ribozimas conforman, en lugar de estar compuestas por, un núcleo central conservado flanqueado por tres hélices de doble cadena (I, II y III), generalmente coronadas por bucles cortos (1, 2,3), asemejándose a una Y en la que las hélices II y III son prácticamente colineales (Martick y Scott 2006).
Estudios anteriores predichos por análisis in vitro e in vivo confirmaron el contacto físico entre los bucles 1 y 2 y mostraron que esta interacción es crítica a niveles fisiológicos bajos de Mg2+ (De la Pena et al, 2003; Khvorova et al., 2003). Se desconoce si el paso de ligación también está mediado in vivo por estos motivos. Pruebas in vitro demostraron que tienen la capacidad de realizar esta reacción (Przybilski, et al. 2005; Przybilski y Hammann 2007a; Przybilski y Hammann 2007b).
Elementos de alta estructura. Las covariaciones entre los bucles de las horquillas de la estructura secundaria más estable para la secuencia de PLMVd tienen una potencial interacción de emparejamiento de bases entre estas dos horquillas, lo que sugiere la adopción, al menos en algunas variantes, de interacciones de bucle de beso (Ambros y Flores 1998; Ambros, et al. 1998). Recientes sondeos in vitro confirman esta interacción (Dube, et al. 2010). Enfoques similares a los del PSTVd, han revelado que otro elemento de estructura terciaria entre dos nucleótidos conservados se encuentra en la secuencia de la cadena (+) del PLMVd. Las hojas infectadas con PLMVd e irradiadas con UV confirmaron que este elemento de estructura terciaria existe in vivo (Hernández, et al. 2006), pero su papel funcional sigue siendo desconocido. La forma lineal monomérica de ELVd (+) tiene el potencial de traficar al núcleo y posteriormente a los plástidos, donde tiene lugar la replicación, lo que sugiere que el tráfico podría estar regulado por un motivo de ARN restringido al dominio terminal izquierdo de ELVd (Pallas, et al. 2012).