Diversità morfologica della formazione della blastula e della gastrulazione nei ricci di mare temnopleurid | Biology Open

DISCUSSIONE

In questo studio, le strutture delle blastule e delle gastrule hanno indicato caratteristiche specie-specifiche tra quattro temnopleuridi (Figg. 1-4). La forma e la posizione (vegetale o laterale) dei blastomeri nelle blastule differiva tra le specie. I blastomeri vagamente adiacenti sulla parete blastulare di T. toreumaticus avevano una forma globosa fino allo stadio di blastula rugosa (Fig. 1). In T. toreumaticus il numero di cellule alla schiusa è solo 500, mentre in altre specie è 600-800 (Masuda, 1979). Poiché il diametro delle blastule è simile tra queste specie (Kitazawa et al., 2010), suggeriamo che meno scissioni causano la differenza nella forma cellulare e l’adesione tra i blastomeri allo stesso stadio di sviluppo. La formazione di blastula rugosa è stata conosciuta solo in specie a sviluppo diretto nei ricci di mare (Henry et al., 1991). Tuttavia, gli embrioni di T. toreumaticus, nonostante sia una specie a sviluppo indiretto, formano blastule rugose (Kitazawa et al., 2009, 2010). Come caratteristiche e ragioni per formare le rughe negli sviluppatori diretti, come Heliocidaris erythrogramma, si considera che i loro embrioni si sviluppano sotto lo stretto spazio perivitellino e formano le rughe a seconda della prima linea cellulare, i loro blastomeri aderiscono debolmente e le loro blastule rugose rilasciano piccole gocce di lipidi nel blastocoel (Henry et al., 1991). I risultati degli studi attuali e precedenti (Kitazawa et al., 2009, 2010) coincidono con il meccanismo degli sviluppatori diretti tranne che per il rilascio di lipidi. Tuttavia, è stato osservato che c’erano alcuni granuli ECM invece di lipidi nel blastocoel di embrioni di T. toreumaticus (Fig. 1B). Gli embrioni di questa specie hanno indicato alcune caratteristiche diverse rispetto agli altri temnopleuridi e queste differenze potrebbero anche essere un’altra ragione per la formazione di blastule rugose.

Le blastule dei temnopleuridi studiati hanno blastomeri con diversi tipi di strutture simili a pseudopodi (Figg. 1-4). In T. toreumaticus, i blastomeri intorno alle presunte PMC hanno esteso pseudopodi ad esse (Fig. 1G,H). Immers (1961) ha indicato che nei ricci di mare la formazione di proiezioni filopodiali delle cellule del mesenchima è sostenuta da una matrice di polisaccaridi solfati combinati con proteine. Le differenze nella forma delle strutture simili a pseudopodi tra i temnopleuridi possono essere causate da diverse sostanze all’interno della matrice. Recentemente, Yaguchi et al. (2015) hanno indicato che l’adesione tra i blastomeri alle prime scissioni era molto lasca, e che i blastomeri avevano molte sporgenze attaccate alla ECM esterna e allo strato ialino al solco di scissione in T. reevesii. Inoltre, era difficile dividere ogni blastomero dei primi embrioni in fase di clivaggio di T. hardwickii e M. globulus a causa della ECM esterna e dello strato ialino (dati non mostrati). Tuttavia, nelle nostre osservazioni delle blastule, lo spazio tra i blastomeri è diventato stretto e collegato da strutture complesse simili a pseudopodi (Fig. 2). I blastomeri intorno alle PMC presunte sembravano formare strati da strutture pseudopodali allungate (Fig. 2I). Questi fenomeni indicano che l’adesione tra i blastomeri cambia da sciolto a stretto. Il lavoro futuro dovrebbe analizzare se le prime protrusioni formano le strutture simili a pseudopodi allo stadio di blastula.

La distribuzione delle ECMs era diversa tra le specie e la posizione (vegetale o laterale). La superficie blastocoelica sviluppa molti tipi di ECM che includono mucopolisaccaridi (Okazaki e Niijima, 1964), glicoproteine, fibronectina e laminina (Spiegel et al., 1983; Benson et al., 1999), e collagene (Kefalides et al., 1979; Crise-Benson e Benson, 1979). Inoltre, nella lamina basale la distribuzione di fibronectina e laminina differisce tra le specie (Spiegel et al., 1983; Katow et al., 1982). La superficie blastocoelica della placca vegetale di T. toreumaticus aveva una struttura simile a un buco nella ECM (Fig. 1G,H). Questo era assente nelle altre specie (Figg. 2-4). In Lytechinus variegatus, le superfici blastocoeliche erano coperte da una sottile lamina basale composta da materiali fibrosi e non fibrosi prima dell’ingressione della PMC e poi una ECM simile ad una ragnatela si è localizzata nell’emisfero animale (Galileo e Morrill, 1985). Galileo e Morrill (1985) hanno trovato che i blastomeri, prima di schiudersi sulla parete del blastocoel, erano intrecciati e avevano una rete irregolare di ECM. Erano collegati tra loro da sottili processi cellulari perpendicolari all’asse animale-vegetale. Inoltre, la parete del blastocoel intorno all’emisfero animale ha sviluppato un foro senza ECM. Recentemente è stato riportato che le PMC presunte perdono la distribuzione di laminina legata al sub-circuito della rete di regolazione dei geni per il rimodellamento della lamina basale che includono tbr, dri e hex mediante il knockdown di questi geni (Saunders e McClay, 2014). Pertanto, suggeriamo che la struttura simile a un buco osservata in T. toreumaticus può essere formata da laminina aggiunta da questi geni, e che gli embrioni dei temnopleuridi nel nostro studio possono avere diversa quantità e distribuzione di laminina. L’esame delle fotografie pubblicate da Amemiya (1989) di Hemicentrotus pulcherrimus e Pseudocentrotus depressus ha rivelato che i blastomeri del lato animale si allungano verso il polo vegetale. Tuttavia, gli embrioni non hanno formato un foro vegetale nell’ECM. Inoltre, Amemiya (1989) ha riportato che il patterning PMC è causato dall’accumulo di fibrille della lamina basale. Questa relazione supporta i nostri risultati che il foro ECM di T. toreumaticus può attaccare le PMC alla piastra vegetale. Il fissativo usato nel nostro studio era molto simile al metodo privo di ioni di calcio di Amemiya (1989). Pertanto, i nostri risultati possono indicare che ci sono differenze nella distribuzione di una ECM calcio-dipendente tra le specie e che T. toreumaticus ha molta ECM calcio-dipendente o ECM calcio-indipendente.

In M. globulus, ogni blastomero della blastula è diventato situato vicino alla superficie insieme a strutture di filamenti intorno all’ottava scissione. Una struttura simile a un foglio di mucopolisaccaridi sulla superficie blastocoelica è stata identificata per il movimento delle SMC su queste strutture (Endo e Uno, 1960). Nel nostro studio, non abbiamo identificato strutture filamentose ben sviluppate nelle blastule di M. globulus ma abbiamo osservato alcune ECM sulla superficie blastocoelica (Fig. 4E). Endo (1966) ha riferito che in Mespilia quando le PMC ingressano, si liberano del loro citoplasma apicale mentre sono ancora attaccate da desmosomi alle cellule vicine. D’altra parte, in Arbacia (Gibbins et al., 1969) e Lytechinus pictus (Katow e Solursh, 1980), i desmosomi scompaiono dalle PMC. Pertanto, l’analisi dell’ultrastruttura della parete blastulare tra questi temnopleuridi è necessaria in futuro.

L’ECMs è importante per il movimento cellulare, come la migrazione delle PMC per la differenziazione delle PMC, la modulazione della polarità delle cellule epiteliali e la gastrulazione (Solursh e Lane, 1988; Katow et al, 1982; Fink e McClay, 1985; Amemiya, 1989; Adelson e Humphreys, 1988; Ingersoll e Ettensohn, 1994; Berg et al., 1996). In L. pictus, le PMC hanno sei tipi di processi cellulari, a seconda di un componente specifico del substrato della lamina basale, che sono coinvolti nel comportamento migratorio delle cellule (Katow e Solursh, 1981). Nel nostro studio, le PMC di T. reevesii, T. hardwickii e M. globulus sono entrate separatamente. Suggeriamo che in T. toreumaticus, l’ingressione delle PMC in massa può essere causata dalla distribuzione interna dell’ECM alla piastra vegetale. Abbiamo anche osservato alcuni tipi di strutture di processo (Figg. 1-4) e suggeriamo che queste strutture possono causare il movimento cellulare.

Gastrulazione in T. reevesii, e T. hardwickii e M. globulus è per invaginazione graduale con un periodo di ritardo (Figg. 2-5). Ciò significa che i meccanismi di gastrulazione in questi temnopleuridi possono essere diversi da quelli di T. toreumaticus con invaginazione continua. Anche se i tempi dell’inizio dell’invaginazione in T. toreumaticus e M. globulus nel nostro studio erano diversi da quelli riportati da Takata e Kominami (2004), ciò suggerisce che le differenze tra i lotti di embrioni o la posizione geografica (area di Yamaguchi nel presente studio; aree di Kouchi e Ehime in Takata e Kominami, 2004) della stessa specie possono causare diverse velocità di sviluppo degli embrioni.

I meccanismi di invaginazione dell’archenteron di ogni specie sono stati considerati secondo quattro fattori: spinta delle cellule vegetali nel blastocoel per crescita delle cellule al polo animale (Takata e Kominami, 2001), allungamento delle cellule che formano l’archenteron, riarrangiamento delle cellule che formano l’archenteron lungo l’asse animale-vegetale e indurimento del rudimento intestinale da parte dei filopodi delle SMC ingerite nel blastocoel dalla punta dell’archenteron (Ettensohn, 1985; Hardin, 1988; Dan e Okazaki, 1956; Gustafson e Kinnander, 1956; Tabella 2). In T. toreumaticus, il blastoporo diventa stretto alla fine dell’invaginazione (Fig. 7B). Il blastoporo di Scaphechinus milabilis, che ha un’invaginazione continua diventa stretto intorno alla fine dell’invaginazione (Kominami e Masui, 1996). Pertanto, suggeriamo che l’archenteron di T. toreumaticus possa anche allungarsi attraverso l’ingressione continua delle cellule intorno al blastoporo nel blastocoel. Nei ricci di mare irregolari con invaginazione continua, il diametro dell’archenteron durante l’invaginazione non cambia in modo che il riordinamento delle cellule non influisce sull’allungamento dell’archenteron (Kominami e Masui, 1996; Takata e Kominami, 2004). Tuttavia, abbiamo osservato che in T. toreumaticus il diametro dell’arcenterone medio e lo spessore della parete dell’arcenterone sono diminuiti rapidamente. C’è la possibilità che la riorganizzazione e l’allungamento delle cellule dell’archenteron causino l’allungamento dell’archenteron. In T. toreumaticus e nei ricci di mare irregolari, i primi eventi di sviluppo, tra cui l’ingressione delle PMC, l’inizio dell’invaginazione dell’arcenterone e la formazione delle SMC, iniziano e terminano in fasi relativamente precoci. Questo suggerisce che gli eventi di sviluppo possono essere accelerati e omessi nel complesso, e poi coinvolti la continua invaginazione dell’arcenterone. In questa specie le SMCs e i filopodi allungati si sono formati verso la fine dell’invaginazione, il che significa che le SMCs potrebbero non indurire l’archenteron. Il grado finale di invaginazione è circa il 94% (Fig. 5B) e i canali dei pori primari di questa specie non mantengono la larghezza del corpo (Kitazawa et al., 2014). Suggeriamo che l’invaginazione continua avviene per allungamento dell’archenteron stesso.

In T. reevesii, lo spessore della parete dell’archenteron è diminuito dopo il periodo di ritardo (Fig. 5C). Questo suggerisce che l’allungamento delle cellule causa l’allungamento dell’arcenterone. Il diametro e lo spessore della parete dell’archenteron a metà dell’archenteron sono diminuiti. Questo suggerisce che un’altra diminuzione è stata causata dalla riorganizzazione delle cellule nell’archenteron (Fig. 8D,E). È possibile che le SMC causino l’allungamento dell’arcenterone a causa del lungo periodo di ritardo e del periodo di invaginazione secondaria in questa specie (Fig. 5C), e le SMC formano filopodi durante l’invaginazione secondaria. Dopo l’inizio dell’invaginazione, lo spessore della punta dell’archenteron è diventato sottile temporalmente solo in questa specie (dati non mostrati).

In T. hardwickii, il diametro del blastoporo è diminuito dalla fine della prima invaginazione all’inizio dell’invaginazione secondaria (Fig. 5D). Come S. milabilis (Kominami e Masui, 1996), i risultati suggeriscono che questa diminuzione di T. hardwickii può essere causata dalla crescita al polo animale che spinge le cellule al polo vegetale causando l’allungamento dell’archenteron. Il diametro dell’archenteron medio è diminuito durante il periodo di ritardo (Fig. 8F), causato dal riordinamento delle cellule dell’archenteron lungo l’asse animale-vegetale. Lo spessore della parete dell’archenteron era costante (Fig. 8G) e può significare che l’allungamento dell’archenteron non è causato dall’allungamento delle cellule, ma dal riordinamento delle cellule. Le SMC con filopodia sono state osservate durante l’invaginazione secondaria, ed è possibile che le SMC causino l’allungamento dell’archenteron. Tuttavia, l’invaginazione in T. hardwickii è terminata a circa il 60% dell’intera lunghezza embrionale e le SMC sono state identificate solo verso la fine dell’invaginazione. Pertanto, è possibile che le SMC con filopodia non causino l’allungamento dell’arcenterone ma induriscano la punta dell’arcenterone nella regione orale presunta.

In M. globulus, le cellule dell’arcenterone sono diventate sottili dalla fine del periodo di ritardo all’inizio dell’invaginazione secondaria (Fig. 8H,I). Takata e Kominami (2004) hanno riportato che in M. globulus il riarrangiamento non era notevole. La punta dell’archenteron non si è attaccata alla placca apicale, né le SMC si sono disperse nel blastocoel. Inoltre, il numero di cellule dell’archenteron non è cambiato. Pertanto, si suggerisce che l’allungamento delle cellule per formare l’archenteron causa l’allungamento dell’archenteron. Il diametro del blastoporo è diminuito durante l’invaginazione (Fig. 7E), il che significa che la spinta delle cellule vegetali dalla crescita delle cellule animali può causare l’allungamento dell’archenteron in questa specie.

La formazione delle SMC è avvenuta allo stesso tempo nei quattro temnopleuridi studiati. Tuttavia, le tre specie con invaginazione graduale hanno avuto bisogno di un periodo di invaginazione più lungo rispetto alle specie con invaginazione continua e il loro rapporto di invaginazione finale era di circa il 60% (Fig. 5). Le loro SMC hanno formato filopodia durante il periodo di invaginazione tardiva (Fig. 5) ed è possibile che le SMC cambino la direzione dell’allungamento dell’arcenteron verso la regione orale presuntiva indurendo la punta dell’arcenteron. Inoltre, Amemiya et al. (1982) hanno riportato che gli pseudopodi delle SMC possono tirare su l’arcenterone in H. pulcherrimus e P. depressus ma non in A. crassispina perché non forma molti pseudopodi.

I diametri alla punta dell’arcenterone indicano cambiamenti diversi tra le specie (Fig. 9). Questi risultati indicano che la caratteristica all’estremità dell’arcenterone può causare l’invaginazione specie-specifica o il processo di formazione dei sacchetti celomici. Questa conclusione è supportata dai risultati che il modello di formazione del canale poro primario dalle sacche celomiche è diverso tra queste specie (Kitazawa et al., 2012, 2014).

I nostri risultati indicano che i temnopleuridi hanno differenze specie-specifiche durante la morfogenesi precoce, compresa la formazione della blastula e l’invaginazione dell’archenteron compresi i fattori efficaci nella stessa famiglia (Tabelle 1 e 2, Fig. 10). Temnopleurus toreumaticus sviluppa alcune caratteristiche specie-specifiche come l’uovo rugoso e la formazione della blastula rugosa nelle prime fasi di sviluppo (Kitazawa et al., 2009, 2010). L’analisi filogenetica basata sui dati allozyme dei temnopleuridi suggerisce che T. toreumaticus e T. reevesii sono più strettamente correlati di T. hardwickii e M. globulus (Matsuoka e Inamori, 1996). Tuttavia, sulla base di analisi morfologiche e molecolari, Jeffery et al. (2003) hanno determinato che M. globulus e T. reevesii sono più strettamente correlati tra loro che a T. toreumaticus. Recentemente, abbiamo anche osservato lo sviluppo di un altro temnopleurid, Temnotrema sculptum e questa specie è molto simile a T. reevesii, T. hardwickii e M. globulus, ma non T. toreumaticus (Fujii et al., 2015). Pertanto, ipotizziamo che dopo la divergenza, T. toreumaticus ha evoluto più specie-specificità nelle prime fasi di sviluppo rispetto ad altri temnopleuridi. Tuttavia, rimane ancora da scoprire perché le differenze nella morfogenesi nei primi stadi di sviluppo si sono evolute in questo gruppo anche se queste specie mostrano caratteristiche molto simili, come la dimensione delle uova, il tasso generale di sviluppo, o la morfologia larvale. C’è la possibilità che alcune differenze nei fondamentali eventi di sviluppo conservati nei primi stadi di sviluppo tra i temnopleuridi possano accumularsi attraverso la deriva casuale, purché non interrompano lo sviluppo complessivo attraverso la deriva dei sistemi di sviluppo come proposto da True e Haag (2001).