Diversidade morfológica da formação de blastulas e gastrulação em ouriços temnopleurídeos do mar | Biologia Aberta
DISCUSSÃO
Neste estudo, as estruturas das blastulas e dos ouriços temnopleurídeos indicaram características específicas da espécie entre quatro temnopleurídeos (Figs 1-4). A forma e a posição (vegetal ou lateral) dos blastómeros nos blastómeros diferiram entre as espécies. Os blastómeros vagamente adjacentes na parede blástica de T. toreumaticus tinham uma forma globular até à fase da blastula enrugada (Fig. 1). Em T. toreumaticus o número de células na eclosão é de apenas 500, enquanto que noutras espécies é de 600-800 (Masuda, 1979). Como o diâmetro da blastula é semelhante entre estas espécies (Kitazawa et al., 2010), sugerimos que menos clivagens causam a diferença na forma celular e na adesão entre os blastómeros na mesma fase de desenvolvimento. A formação de blástulas rugosas tem sido conhecida apenas em espécies em desenvolvimento directo em ouriços-do-mar (Henry et al., 1991). Contudo, embriões de T. toreumaticus, apesar de ser uma espécie em desenvolvimento indirecto, formam blastos enrugados (Kitazawa et al., 2009, 2010). Como características e razões para formar rugas em criadores directos, como Heliocidaris erythrogramma, considera-se que os seus embriões se desenvolvem sob o estreito espaço perivitelino e formam rugas dependendo da linhagem celular inicial, os seus blastómeros colam-se fracamente e os seus blastómeros enrugados libertam pequenas gotículas lipídicas no blastocoel (Henry et al., 1991). Os resultados do presente e de estudos anteriores (Kitazawa et al., 2009, 2010) coincidem com o mecanismo dos reveladores directos, excepto para a libertação de lípidos. No entanto, observou-se que havia alguns grânulos de ECM em vez de lípidos no blastocoel de embriões de T. toreumaticus (Fig. 1B). Os embriões desta espécie indicaram algumas características diferentes em comparação com outros temnopleurídeos e estas diferenças também podem ser outra razão para a formação de blastos enrugados.
Os blastos dos temnopleurídeos estudados têm blastómeros com diferentes tipos de estruturas semelhantes a pseudopodas (Figs 1-4). Em T. toreumaticus, os blastómeros em torno dos presumíveis PMC estenderam-lhes pseudopods (Fig. 1G,H). Immers (1961) indicava que nos ouriços do mar a formação de projecções filopodiais de células mesenquimais é suportada por uma matriz de polissacáridos sulfatados combinados com proteínas. As diferenças na forma das estruturas semelhantes a pseudopodas entre os temnopleurídeos podem ser causadas por diferentes substâncias dentro da matriz. Recentemente, Yaguchi et al. (2015) indicaram que a adesão entre os blastómeros nas clivagens iniciais era muito solta, e que os blastómeros tinham muitas saliências ligadas ao ECM externo e à camada hialina no sulco de clivagem em T. reevesii. Também, era difícil dividir cada blastômero dos embriões de T. hardwickii e de M. globulus na clivagem precoce devido ao ECM externo e à camada hialina (dados não mostrados). Contudo, nas nossas observações de blastómeros, o espaço entre os blastómeros tornou-se estreito e ligado por estruturas complexas semelhantes a pseudopodas (Fig. 2). Os blastómeros em torno dos presumíveis PMC pareciam formar camadas por estruturas alongadas semelhantes a pseudopodas (Fig. 2I). Estes fenómenos indicam que a aderência entre os blastómeros muda de solta para apertada. O trabalho futuro deve analisar se as protuberâncias iniciais formam as estruturas semelhantes a pseudopoderes na fase da blastula.
A distribuição dos ECMs foi diferente entre espécies e posição (vegetal ou lateral). A superfície blastocoélica desenvolve muitos tipos de ECMs que incluem mucopolissacarídeos (Okazaki e Niijima, 1964), glicoproteínas fibronectina, e lamina (Spiegel et al., 1983; Benson et al., 1999), e colagénio (Kefalides et al., 1979; Crise-Benson e Benson, 1979). Além disso, na lâmina basal, a distribuição de fibronectina e lamina difere entre as espécies (Spiegel et al., 1983; Katow et al., 1982). A superfície blastocoélica da placa vegetal de T. toreumaticus tinha uma estrutura semelhante a um buraco no ECM (Fig. 1G,H). Isto estava ausente nas outras espécies (Figs 2-4). No Lytechinus variegatus, as superfícies blastocoelicas foram cobertas com uma fina lâmina basal composta por materiais fibrosos e não fibrosos antes da ingressão do PMC e depois um ECM em forma de teia tornou-se localizado no hemisfério animal (Galileo e Morrill, 1985). Galileo e Morrill (1985) descobriram que os detonadores, antes de eclodirem na parede do blastocoel, estavam entrelaçados e tinham uma malha irregular de ECM. Estavam ligados por processos celulares finos um ao outro perpendiculares ao eixo animal-vegetal. Além disso, a parede de blastocoel em torno do hemisfério animal desenvolveu um buraco sem ECM. Recentemente foi relatado que os presumíveis PMCs perdem a distribuição da lamina relacionada com o sub-circuito da rede reguladora de genes para a remodelação da lamina basal que inclui o tbr, gotejamento e hexadecimal por knockdown destes genes (Saunders e McClay, 2014). Portanto, sugerimos que a estrutura tipo buraco observada no T. toreumaticus pode ser formada de lamina adicionada por estes genes, e que os embriões dos temnopleurídeos no nosso estudo podem ter quantidades e distribuição diferentes de lamina. O exame das fotografias publicadas por Amemiya (1989) de Hemicentrotus pulcherrimus e Pseudocentrotus depressus revelou que os blastómeros do lado animal se alongam até ao pólo vegetal. No entanto, os embriões não formaram um buraco vegetal no ECM. Além disso, Amemiya (1989) relatou que o PMC patterning é causado pela acumulação de fibrilhas da lâmina basal. Este relatório apoia as nossas conclusões de que o buraco de ECM de T. toreumaticus pode fixar PMCs na placa vegetal. O fixador utilizado no nosso estudo foi muito semelhante ao método sem iões de cálcio em Amemiya (1989). Portanto, os nossos resultados podem indicar que existem diferenças na distribuição de um ECM dependente do cálcio entre as espécies e que o T. toreumaticus tem muito ECM dependente do cálcio ou ECM independente do cálcio.
Em M. globulus, cada blastômero da blástula ficou localizado perto da superfície juntamente com estruturas de filamentos em torno da oitava clivagem. Foi identificada uma estrutura em forma de folha de mucopolissacarídeos na superfície blastocoélica para o movimento de SMC nestas estruturas (Endo e Uno, 1960). No nosso estudo, não identificámos estruturas filamentosas bem desenvolvidas em blastulae de M. globulus, mas observámos alguns ECMs na superfície blastocoélica (Fig. 4E). Endo (1966) relatou que em Mespilia, quando os PMCs entram, eliminam o seu citoplasma apical enquanto ainda estão presos por desmosomas às células vizinhas. Por outro lado, em Arbacia (Gibbins et al., 1969) e Lytechinus pictus (Katow e Solursh, 1980), os desmosomas desaparecem dos PMCs. Por conseguinte, a análise da ultraestrutura da parede da blastulação entre estes temnopleurídeos é necessária no futuro.
Os ECMs são importantes para o movimento celular, tais como a migração de PMC para diferenciação de PMC, modulação da polaridade epitelial das células, e gastrulação (Solursh e Lane, 1988; Katow et al.., 1982; Fink e McClay, 1985; Amemiya, 1989; Adelson e Humphreys, 1988; Ingersoll e Ettensohn, 1994; Berg et al., 1996). Em L. pictus, os PMCs têm seis tipos de processos celulares, dependendo de um componente específico do substrato da lâmina basal, que estão envolvidos no comportamento migratório celular (Katow e Solursh, 1981). No nosso estudo, os PMCs de T. reevesii, T. hardwickii e M. globulus foram introduzidos separadamente. Sugerimos que em T. toreumaticus, a ingressão em massa de PMC pode ser causada pela distribuição interna de ECM na placa vegetal. Também observámos algum tipo de estruturas de processo (Figs 1-4) e sugerimos que estas estruturas podem causar movimento celular.
Gastrulação em T. reevesii, e T. hardwickii e M. globulus é por invaginação gradual com um período de atraso (Figs 2-5). Isto significa que os mecanismos de gastrulação nestes temnopleurídeos podem ser diferentes dos de T. toreumaticus com invaginação contínua. Embora o momento do início da invaginação em T. toreumaticus e M. globulus no nosso estudo fosse diferente do relatado por Takata e Kominami (2004), sugere que as diferenças entre lotes de embriões ou localização geográfica (área Yamaguchi no presente estudo; áreas Kouchi e Ehime em Takata e Kominami, 2004) da mesma espécie podem causar diferentes velocidades de desenvolvimento de embriões.
Os mecanismos de invaginação do arquipélago de cada espécie foram considerados de acordo com quatro factores: empurrando as células vegetais para o blastocoel por crescimento celular no pólo animal (Takata e Kominami, 2001), alongamento das células que formam o arcentroon, reorganização das células que formam o arcentroon ao longo do eixo animal-vegetal e endurecimento do rudimento intestinal pelo filópode dos SMCs que entram no blastocoel a partir da ponta do arcentroon (Ettensohn, 1985; Hardin, 1988; Dan e Okazaki, 1956; Gustafson e Kinnander, 1956; Quadro 2). Em T. toreumaticus, o blastopore tornou-se estreito no final da invaginação (Fig. 7B). O blastopore de Scaphechinus milabilis, que tem invaginação contínua, torna-se estreito no final da invaginação (Kominami e Masui, 1996). Portanto, sugerimos que o arcentro de T. toreumaticus também pode alongar-se pela ingressão contínua das células à volta do blastopore para o blastocoel. Em ouriços do mar irregulares com invaginação contínua, o diâmetro do arquentroon durante a invaginação não se altera para que o rearranjo celular não afecte o alongamento do arquentroon (Kominami e Masui, 1996; Takata e Kominami, 2004). Contudo, observámos que em T. toreumaticus o diâmetro no meio do arcentroon e a espessura da parede do arcentroon diminuiu rapidamente. Existe a possibilidade de que o rearranjo e alongamento das células do arcentroon provoque o alongamento do arcentroon. Em T. toreumaticus e ouriços do mar irregulares, os eventos de desenvolvimento precoce, incluindo a ingressão dos PMCs, o início da invaginação do arquentroon, e a formação dos PMCs, começam e terminam em fases relativamente precoces. Isto sugere que os eventos de desenvolvimento podem ser acelerados e omitidos globalmente, e depois envolveram a invaginação contínua do arquentroon. Nesta espécie, os SMC e a filopodia alongada formaram-se perto do fim da invaginação, o que significa que os SMC podem não endurecer o arquentroon. O grau final de invaginação é de cerca de 94% (Fig. 5B) e os canais primários de poros desta espécie não mantêm a largura do corpo (Kitazawa et al., 2014). Sugerimos que a invaginação contínua ocorre por alongamento do próprio archenteron.
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Sumário de gastrulação de quatro temnoleuridas
Em T. reevesii, a espessura da parede do arcentroon diminuiu após o período de atraso (Fig. 5C). Isto sugere que o alongamento celular provoca o alongamento do arquentroon. O diâmetro e a espessura da parede do arcentroon no meio do arcentroon diminuiu. Isto sugere que outra diminuição foi causada pelo rearranjo das células do arquentroon (Fig. 8D,E). É possível que os SMCs causem alongamento do arquentro devido ao longo período de atraso e período de invaginação secundária nesta espécie (Fig. 5C), e os SMCs formaram filopódios durante a invaginação secundária. Após o início da invaginação, a espessura da ponta do arcentroon tornou-se fina temporariamente apenas nesta espécie (dados não mostrados).
Em T. hardwickii, o diâmetro do blastopore diminuiu desde o fim da primeira invaginação até ao início da invaginação secundária (Fig. 5D). Como S. milabilis (Kominami e Masui, 1996), os resultados sugerem que esta diminuição de T. hardwickii pode ser causada pelo crescimento no pólo animal empurrando as células no pólo vegetal causando o alongamento do arquentroon. O diâmetro no arquentro médio diminuiu durante o período de atraso (Fig. 8F), causado pelo rearranjo das células do arquentro ao longo do eixo animal-vegetal. A espessura da parede do archenteron era constante (Fig. 8G) e pode significar que o alongamento do archenteron não é causado pelo alongamento das células, mas pelo rearranjo das células. Foram observadas SMCs com filopodia durante a invaginação secundária, e é possível que as SMCs causem alongamento do arquentroon. Contudo, a invaginação em T. hardwickii terminou em cerca de 60% de todo o comprimento embrionário e as LMCs só foram identificadas perto do fim da invaginação. Portanto, é possível que as SMCs com filopodia não causem alongamento do arquentroon, mas endureçam a ponta do arquentroon na presumível região oral.
Em M. globulus, as células do arquentroon tornaram-se finas desde o fim do período de atraso até ao início da invaginação secundária (Fig. 8H,I). Takata e Kominami (2004) relataram que em M. globulus o rearranjo não foi notável. A ponta do arcentroon não se prendeu à placa apical, nem os SMCs se dispersaram no blastocoel. Além disso, o número de células do arcentroon não mudou. Portanto, sugere-se que o alongamento das células para formar o arcentroon provoca o alongamento do arcentroon. O diâmetro do blastopore diminuiu durante a invaginação (Fig. 7E), o que significa que o empurrão das células vegetais pelo crescimento das células animais pode causar alongamento do arquentroon nesta espécie.
Formação dos SMCs ocorreu ao mesmo tempo nos quatro temnopleurídeos estudados. Contudo, as três espécies com invaginação escalonada necessitaram de um período de invaginação mais longo do que as espécies com invaginação contínua e a sua razão de invaginação final foi de aproximadamente 60% (Fig. 5). Os seus SMC formaram filopódios durante o período de invaginação tardia (Fig. 5) e é possível que os SMC mudem a direcção de alongamento do arquentro para a presumível região oral, endurecendo a ponta do arquentro. Além disso, Amemiya et al. (1982) relataram que a pseudopodia dos SMCs pode puxar o arquenteron em H. pulcherrimus e P. depressus mas não em A. crassispina porque não forma muitos pseudopodia.
Os diâmetros na ponta do arquenteron indicam diferentes mudanças entre as espécies (Fig. 9). Estes resultados indicam que a característica na ponta do arcentroon pode causar invaginação específica da espécie ou o processo formativo das bolsas coelómicas. Esta conclusão é apoiada por descobertas de que o padrão de formação do canal primário dos poros das bolsas celómicas é diferente entre estas espécies (Kitazawa et al., 2012, 2014).
Os nossos resultados indicam que os temnopleurídeos têm diferenças específicas das espécies durante a morfogénese precoce, incluindo a formação de blástulas e a invaginação do arquentroon, incluindo factores efectivos na mesma família (Tabelas 1 e 2, Fig. 10). Temnopleurus toreumaticus desenvolve algumas características específicas da espécie como ovo enrugado e formação de blástula enrugada nas fases iniciais de desenvolvimento (Kitazawa et al., 2009, 2010). A análise filogenética baseada em dados allozyme de temnopleurids sugere que T. toreumaticus e T. reevesii estão mais intimamente relacionados do que T. hardwickii e M. globulus (Matsuoka e Inamori, 1996). No entanto, com base na análise morfológica e molecular, Jeffery et al. (2003) determinaram que M. globulus e T. reevesii estão mais intimamente relacionados um com o outro do que com T. toreumaticus. Recentemente, observámos também o desenvolvimento de outro temnopleurid, Temnotrema sculptum e esta espécie é muito semelhante a T. reevesii, T. hardwickii e M. globulus, mas não a T. toreumaticus (Fujii et al., 2015). Por conseguinte, colocamos a hipótese de que, após a divergência, T. toreumaticus evoluiu mais espécies específicas em fases iniciais de desenvolvimento do que outros temnopleurídeos. No entanto, ainda está por descobrir porque é que as diferenças de morfogénese nas fases iniciais de desenvolvimento evoluíram neste grupo, embora estas espécies apresentem características muito semelhantes, tais como o tamanho dos ovos, taxa geral de desenvolvimento, ou morfologia larvar. Existe a possibilidade de que algumas diferenças em eventos de desenvolvimento fundamentais conservados nas fases iniciais de desenvolvimento entre os temnopleurídeos possam acumular-se através da deriva aleatória, desde que não perturbem o desenvolvimento global através da deriva dos sistemas de desenvolvimento, como proposto por True e Haag (2001).
Sumário da formação de blástula e gástrula em quatro temnopleuridas. Diagramas esquemáticos da parte vegetal dos embriões, vista lateral. Linhas azuis, ECM. Blastulos em T. toreumaticus desenvolvem ECM bem na superfície blastocoélica e depois entram em massa em células mesenquimétricas primárias orbiculares a partir de uma estrutura tipo buraco de ECM e finalmente invaginam continuamente. Por outro lado, os blastulae em T. reevesii, T. hardwickii e M. globulus formam blastômeros com pseudopods na parede do blastocoélico e depois entram separadamente em células mesênquimas primárias e finalmente invaginam passo a passo por todos ou alguns dos factores: mudança da forma celular, rearranjo, empurrar para cima e reboque de células.