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Rapporto del caso
Una donna di 44 anni ha iniziato a usare L-TRP (1500 mg al giorno) per l’insonnia nel gennaio 2009. Si era sottoposta a un intervento chirurgico di perdita di peso nel 2007 per obesità, e durante i successivi 12 mesi ha perso 140 libbre di peso. Ha consumato L-TRP, venduto con il nome commerciale “Uber rest” distribuito da Heartland Products, che ha acquistato da una farmacia di Chicago. Oltre a L-TRP, ha anche usato L-carnitina, olio di lino e acido alfa-lipoico, ma non ha preso farmaci. Entro tre settimane dall’inizio dell’L-TRP, ha sviluppato un gonfiore alle estremità superiori e inferiori seguito da una grave mialgia e debolezza. Durante le quattro settimane successive, ha notato una progressiva indurazione della pelle nelle estremità superiori e inferiori, ma risparmiando le dita delle mani e dei piedi. L’esame fisico nell’agosto 2009 era notevole per l’indurimento legnoso degli avambracci e delle gambe (Fig. 1A). La palpazione delle estremità prossimali provocava delle mialgie. Il test muscolare manuale ha rivelato una forza di grado 4/5 del Medical Research Council nei muscoli prossimali delle estremità superiori e inferiori con una normale forza distale. Gli esami dei nervi cranici, sensoriali e dei riflessi erano normali.
A. Sono mostrati indurazione ed edema cutaneo nel braccio sinistro ed erano presenti anche in entrambe le estremità superiori e inferiori con fascia palpabilmente ispessita. B. Le immagini di risonanza magnetica assiale con sequenza STIR della coscia hanno rivelato un’alta intensità di segnale nella fascia che circonda i muscoli del compartimento anteriore e posteriore (frecce). C. La tomografia computerizzata del torace ad alta risoluzione mostra cambiamenti del vetro smerigliato e opacità dello spazio aereo nel polmone sinistro (freccia).
L’indagine di laboratorio ha dimostrato una conta elevata dei globuli bianchi (WBC) con il 24% di eosinofili (conta assoluta 1600 cellule/mm3). L’aldolasi sierica era leggermente elevata, ma la creatinchinasi (CK) era normale. I risultati dei seguenti test erano negativi o normali: anticorpi anti-nucleo, anti-DNA a doppio filamento, anti-neutrofili citoplasmatici, anti-Ro, anti-La, anti-Scl-70 e anti-CCP, fattore reumatoide, velocità di sedimentazione eritrocitaria, immunofissazione del siero, ormone stimolante la tiroide e albumina. Gli studi di conduzione nervosa (NCS) hanno rivelato normali risposte motorie e sensoriali nelle estremità superiori e inferiori. L’elettromiografia (EMG) dei muscoli prossimali ha mostrato prove sotto forma di potenziali di unità motoria polifasici di piccola ampiezza e breve durata, con reclutamento precoce, a sostegno della presenza di un processo miopatico. La risonanza magnetica (MRI) delle cosce ha mostrato un edema muscolare e fasciale (Fig. 1B). La tomografia computerizzata ad alta risoluzione (HRCT) del torace ha rivelato un’opacizzazione del polmone sinistro (Fig. 1C). Le biopsie della pelle, della fascia del vasto laterale e del muscolo prelevate prima dell’inizio dell’immunoterapia hanno mostrato cambiamenti istopatologici caratteristici della SGA (Fig. 2). L’immunocolorazione con gli anticorpi contro i prodotti della degranulazione degli eosinofili major basic protein (MBP) e la neurotossina derivata dagli eosinofili (EDN) era fortemente positiva (Figg. 2 H,I). La tipizzazione HLA-DR ha rivelato che il paziente aveva l’allele HLA-DRB1*04, un fattore di rischio tra gli utilizzatori di L-TRP per lo sviluppo di EMS (OR 3,9, 95% CI 1,1-16,4), e l’assenza di qualsiasi allele HLA protettivo riportato.12
Campioni di biopsia cutanea (A) e muscolare (B – I) colorati con ematossilina ed eosina (A – F), tricromia di Gomori (G), e anticorpi contro la neurotossina derivata dagli eosinofili (EDN) (H) e la proteina fondamentale maggiore (MBP) (I). A. Fibrosi cutanea con accumulo di collagene dermico e infiltrazione di eosinofili (freccia). B. Il campione di fascia e muscoli dimostra una densa fibrosi della fascia epidermica (freccia scura) e fascicoli muscolari atrofici (freccia bianca). C. L’ingrandimento a potenza maggiore rivela fibre necrotiche sparse (freccia). D – G. Infiltrato infiammatorio (frecce) nel tessuto connettivo perimisiale (D), nel tessuto connettivo endomisiale (E), intorno al nervo intramuscolare (F) e intorno ai vasi sanguigni intramuscolari (G). Gli eosinofili sono stati rilevati solo raramente. H, I. Analisi di immunofluorescenza. La colorazione EDN (H) e MBP (I) è presente nel tessuto connettivo perimisiale ed endomisiale, così come intorno ai vasi sanguigni intramuscolari e al nervo (non mostrato).
Anche se la L-TRP consumata prima della comparsa dei sintomi non era più disponibile, più campioni contemporanei dello stesso lotto sono stati sottoposti a cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con spettrometria di massa.13 Nessuna impurità è stata rilevata a più di 10 ppm in nessuno dei campioni. In particolare, il derivato idrossilato del triptofano picco C (EBT), picco E (PAA), 2-(2-idrossi indolina)-Trp picco FF, o 2-(3-indolil)-L-triptofano non sono stati rilevati (dati non mostrati).
Con il consenso informato approvato dall’Institutional Review Board della Northwestern University, una singola biopsia cutanea di 3 mm è stata prelevata dall’avambraccio clinicamente interessato per l’analisi microarray. Al momento della biopsia, il paziente stava assumendo prednisone (50 mg/d) e micofenolato mofetile (1000 mg/bid). L’omogeneizzazione della biopsia cutanea è avvenuta in un TissueLyser Qiagen e l’RNA totale è stato isolato utilizzando il kit RNeasy per tessuti fibrosi con automazione nel Qiagen QIAcube. RNA etichettato dalla pelle lesionale è stato ibridato in modo competitivo a 44.000 elementi Agilent oligonucleotide microarray che rappresentano 33.000 geni umani noti e nuovi.14 I campioni sono stati eseguiti in triplicato e confrontati con tre siti anatomici indipendenti e di età corrispondenti biopsie di pelle sana di controllo femminile. I dati grezzi di microarray sono stati depositati nel National Center for Biotechnology Information’s Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo); numero di adesione: GSE26934. I geni differenzialmente espressi tra i controlli sani e le biopsie cutanee EMS sono stati identificati utilizzando Significance Analysis of Microarrays (SAM). Un confronto dell’espressione genica nella biopsia cutanea EMS a quella dei controlli (Fig. 3) ha identificato 343 geni la cui espressione variava significativamente (SAM, false discovery rate ≤ 0.64%). I geni che mostravano un aumento di espressione nella biopsia EMS includevano collageni multipli (collagene V, collagene VI, collagene VIII, collagene XII), molecole della matrice extracellulare (fibronectina, tenascina C, COMP1, elastina, lumicano e Cyr 61), lisil ossidasi, PAI-1, trombospondina, cadherina 11, TIMP-1, e molteplici integrine e cadherina, così come i geni coinvolti nella segnalazione TGF-ß, IL-4 e IL-13.15
L’espressione genica è stata misurata in una biopsia cutanea dello SME in triplicato e in tre biopsie di controllo normali indipendenti per sesso, età e sito anatomico. Tutti i campioni sono stati prelevati dall’avambraccio sinistro. 343 geni differenzialmente espressi sono stati selezionati utilizzando l’analisi di significatività dei microarray (FDR = 0.64%). I geni selezionati sono indicati e quelli discussi nel testo sono in grassetto. La figura completa con tutti i nomi dei geni è disponibile come supplemento Figura S3.
Per determinare se i percorsi TGF-β, IL-4 e IL-13, che sono ciascuno implicato nella fibrosi, erano significativamente regolati in modo differenziato nella biopsia della pelle EMS, un Gene Set Enrichment Analysis è stato eseguito utilizzando set di geni definiti sperimentalmente.15 Tutti i geni misurati sono stati classificati in base alla loro correlazione con una distinzione idealizzata tra il fenotipo sano e il fenotipo EMS (Supplemental Figs. S1A e S2A). Abbiamo poi confrontato gli elenchi di geni classificati percorso a quelli di geni selezionati a caso (Supplemental Figs. S1B e S2B). Ogni percorso ha ricevuto un punteggio di arricchimento (ES), che misura la significatività statistica dell’espressione differenziale. Per determinare se c’è un’associazione significativa con il fenotipo della malattia, un p-value per l’ES è stato calcolato permutando le etichette della matrice e l’ES è stato ricomputato (Figura supplementare S1C e S2C). Per stimare la FDR abbiamo confrontato la ES del percorso determinato sperimentalmente con quella trovata con sottoinsiemi di geni selezionati a caso della stessa dimensione (Figura supplementare S1D e S2D). Questo valuta la probabilità di trovare un ES paragonabile al vero ES se il percorso è effettivamente non correlato alla malattia. Sia il percorso TGF-β (ES 0,3729) che IL-4 (ES 0,2428) sono stati significativamente up-regolati con valori di p e FDR <0,001. Il percorso IL-13 (ES 0.2370) è stato anche aumentato, con un basso FDR (0.0032), ma un alto p-valore (p-value = 0.125). Questo suggerisce che mentre il percorso IL-13 ha mostrato prove di up-regolazione, potrebbe non essere responsabile della distinzione tra la pelle dello SME e la pelle sana di controllo.
Anche se il trattamento con prednisone e micofenolato ha portato ad un modesto miglioramento della forza muscolare prossimale e della mialgia insieme alla pronta risoluzione dell’eosinofilia del sangue periferico e delle opacificazioni di vetro smerigliato viste alla TAC, l’indurimento della pelle e la neuropatia hanno progredito. La ripetizione dell’NCS ha rivelato ampiezze di risposta sensoriale e motoria ridotte o assenti, compatibili con una nuova polineuropatia assonale sensorimotoria dipendente dalla lunghezza che colpisce le estremità superiori e inferiori. L’aggiunta di metotrexate (20 mg alla settimana per 5 mesi) seguita da iniezioni giornaliere di anakinra per 3 mesi non è riuscita a produrre un ulteriore miglioramento della mialgia, della neuropatia o dell’indurimento della pelle.