Morfologische diversiteit van blastula-vorming en gastrulatie bij temnopleuride zee-egels | Biology Open

DISCUSSION

In deze studie toonden de structuren van de blastulae en gastrulae soortspecifieke kenmerken aan bij vier temnopleuriden (Figs 1-4). De vorm en positie (vegetaal of lateraal) van de blastomeren in de blastulae verschilden per soort. De los naast elkaar liggende blastomeren op de blastulawand van T. toreumaticus hadden een bolvorm tot het gerimpelde blastulastadium (Fig. 1). Bij T. toreumaticus bedraagt het aantal cellen bij het uitkomen slechts 500, terwijl dit bij andere soorten 600-800 is (Masuda, 1979). Aangezien de diameter van de blastulae bij deze soorten vergelijkbaar is (Kitazawa et al., 2010), suggereren wij dat minder klieven het verschil in celvorm en adhesie tussen blastomeren in hetzelfde ontwikkelingsstadium veroorzaakt. Gerimpelde blastula-vorming is alleen bekend bij de zich direct ontwikkelende soorten zee-egels (Henry et al., 1991). Echter, embryo’s van T. toreumaticus, ondanks het feit dat dit een indirect ontwikkelende soort is, vormen gerimpelde blastulae (Kitazawa et al., 2009, 2010). Als kenmerken en redenen voor de vorming van rimpels bij directe ontwikkelaars, zoals Heliocidaris erythrogramma, wordt aangenomen dat hun embryo’s zich ontwikkelen onder de nauwe perivitelline ruimte en rimpels vormen afhankelijk van de vroege cellijn, dat hun blastomeren zwak kleven en dat hun gerimpelde blastulae kleine lipidedruppeltjes vrijlaten in de blastocoel (Henry et al., 1991). De resultaten van de huidige en eerdere studies (Kitazawa et al., 2009, 2010) komen overeen met het mechanisme van directe ontwikkelaars, behalve voor het vrijkomen van lipiden. Er werd echter vastgesteld dat er enkele ECM-korrels in plaats van lipiden aanwezig waren in de blastocoel van embryo’s van T. toreumaticus (Fig. 1B). De embryo’s van deze soort vertoonden een aantal verschillende kenmerken in vergelijking met die van andere temnopleuriden en deze verschillen zouden ook een andere reden kunnen zijn voor de gerimpelde blastula-vorming.

De blastulae van de bestudeerde temnopleuriden hebben blastomeren met verschillende soorten pseudopod-achtige structuren (Figs 1-4). Bij T. toreumaticus strekten de blastomeren rond de vermoedelijke PMC’s pseudopoden uit (Fig. 1G,H). Immers (1961) gaf aan dat bij zee-egels de vorming van filopodiale uitsteeksels van mesenchymcellen wordt ondersteund door een matrix van gesulfateerde polysacchariden gecombineerd met proteïnen. De verschillen in vorm van de pseudopod-achtige structuren bij de temnopleuriden kunnen veroorzaakt worden door verschillende stoffen in de matrix. Recent gaven Yaguchi et al. (2015) aan dat de adhesie tussen blastomeren bij de vroege splitsingen erg los was, en dat de blastomeren veel uitsteeksels hadden die vastzaten aan het buitenste ECM en de hyalische laag bij de splitsingsgroef in T. reevesii. Ook was het moeilijk om elk blastomeer van de embryo’s in het vroege doorkliefstadium van T. hardwickii en M. globulus te scheiden vanwege het buitenste ECM en de hyaliene laag (gegevens niet weergegeven). Bij onze waarnemingen van blastulae werd de ruimte tussen de blastomeren echter smal en verbonden door complexe pseudopod-achtige structuren (Fig. 2). De blastomeren rond de vermoedelijke PMC’s leken lagen te vormen door langgerekte pseudopod-achtige structuren (Fig. 2I). Deze verschijnselen wijzen erop dat de adhesie tussen blastomeren verandert van los naar vast. Toekomstig werk moet analyseren of de vroege uitsteeksels de pseudopod-achtige structuren vormen in het blastulastadium.

De verdeling van de ECM’s verschilde per soort en per positie (vegetaal of lateraal). Het blastocoelicale oppervlak ontwikkelt vele soorten ECM’s waaronder mucopolysacchariden (Okazaki en Niijima, 1964), glycoproteïnen fibronectine, en laminine (Spiegel et al., 1983; Benson et al., 1999), en collageen (Kefalides et al., 1979; Crise-Benson en Benson, 1979). Bovendien verschilt de verdeling van fibronectine en laminine in de basale lamina per soort (Spiegel et al., 1983; Katow et al., 1982). Het blastocoelische oppervlak van de vegetale plaat van T. toreumaticus had een gatachtige structuur in het ECM (Fig. 1G,H). Dit was afwezig bij de andere soorten (Fig. 2-4). Bij Lytechinus variegatus waren de blastocoelische oppervlakken bedekt met een dunne basale lamina bestaande uit vezelige en niet-vezelige materialen vóór de PMC-insnijding, waarna een webachtig ECM ontstond ter hoogte van de dierlijke hemisfeer (Galileo en Morrill, 1985). Galileo en Morrill (1985) ontdekten dat de blastomeren, vóór het uitkomen op de blastocoelwand, in elkaar verstrengeld waren en een vlekkerig netwerk van ECM hadden. Ze waren met elkaar verbonden door dunne cellulaire processen loodrecht op de dierlijke-plantaardige as. Bovendien vertoonde de blastocoelwand rond de dierlijke hemisfeer een gat zonder ECM. Onlangs werd gemeld dat de vermoedelijke PMC’s verliezen laminine distributie in verband met het gen regulerende netwerk sub-circuit voor basale lamina remodeling die tbr, dri en hex omvatten door knockdown van deze genen (Saunders en McClay, 2014). Daarom suggereren wij dat de gat-achtige structuur die bij T. toreumaticus is waargenomen, gevormd kan zijn uit laminine dat door deze genen is toegevoegd, en dat embryo’s van de temnopleuriden in onze studie mogelijk een verschillende hoeveelheid en verdeling van laminine hebben. Onderzoek van de door Amemiya (1989) gepubliceerde foto’s van Hemicentrotus pulcherrimus en Pseudocentrotus depressus toonde aan dat de blastomeren van de dierlijke zijde zich uitstrekken naar de vegetale pool. De embryo’s vormden echter geen vegetaal gat in het ECM. Bovendien meldde Amemiya (1989) dat PMC-patroon veroorzaakt wordt door ophoping van fibrillen van de basale lamina. Dit rapport ondersteunt onze bevindingen dat het ECM-gat van T. toreumaticus PMC’s kan vasthechten aan de vegetale plaat. Het fixeermiddel dat in onze studie werd gebruikt, leek sterk op de methode zonder calciumionen in Amemiya (1989). Daarom kunnen onze resultaten erop wijzen dat er verschillen zijn in de verdeling van een calcium-afhankelijk ECM tussen de soorten en dat T. toreumaticus veel calcium-afhankelijk ECM of calcium-onafhankelijk ECM heeft.

In M. globulus kwam elke blastomeer van de blastula dicht bij het oppervlak te liggen, samen met filamentstructuren rond de achtste splitsing. Een velachtige structuur van mucopolysacchariden op het blastocoelicale oppervlak werd geïdentificeerd voor beweging van SMC’s op deze structuren (Endo en Uno, 1960). In onze studie vonden we geen goed ontwikkelde filamenteuze structuren in blastulae van M. globulus, maar we zagen wel enkele ECM’s op het blastocoelische oppervlak (Fig. 4E). Endo (1966) rapporteerde dat in Mespilia wanneer de PMC’s binnendringen, zij hun apicale cytoplasma afwerpen terwijl zij nog steeds door desmosomen aan naburige cellen vastzitten. Anderzijds verdwijnen bij Arbacia (Gibbins et al., 1969) en Lytechinus pictus (Katow and Solursh, 1980) de desmosomen van de PMC’s. Daarom is analyse van de ultrastructuur van de blastulaire wand bij deze temnopleuriden in de toekomst nodig.

De ECMs is belangrijk voor celbeweging, zoals PMC migratie voor PMC differentiatie, modulatie van epitheliale cel polariteit, en gastrulatie (Solursh en Lane, 1988; Katow et al, 1982; Fink en McClay, 1985; Amemiya, 1989; Adelson en Humphreys, 1988; Ingersoll en Ettensohn, 1994; Berg et al., 1996). Bij L. pictus hebben PMC’s zes typen celprocessen, afhankelijk van een specifieke component van het basale lamina substraat, die betrokken zijn bij het celmigratiegedrag (Katow en Solursh, 1981). In onze studie gingen de PMC’s van T. reevesii, T. hardwickii en M. globulus afzonderlijk naar binnen. Wij suggereren dat bij T. toreumaticus, PMC ingressie en masse veroorzaakt kan worden door inwendige ECM verdeling bij de vegetale plaat. We hebben ook een soort processtructuren waargenomen (Figs 1-4) en suggereren dat deze structuren celbeweging kunnen veroorzaken.

Gastrulatie in T. reevesii, en T. hardwickii en M. globulus gebeurt door stapsgewijze invaginatie met een vertragingsperiode (Figs 2-5). Dit betekent dat de mechanismen van gastrulatie bij deze temnopleuriden verschillend kunnen zijn van die van T. toreumaticus met continue invaginatie. Hoewel de timing van het begin van de invaginatie bij T. toreumaticus en M. globulus in onze studie verschilde van die gerapporteerd door Takata en Kominami (2004), suggereert dit dat verschillen tussen partijen embryo’s of geografische locatie (Yamaguchi gebied in de huidige studie; Kouchi en Ehime gebieden in Takata en Kominami, 2004) van dezelfde soort kunnen leiden tot verschillende ontwikkelingssnelheden van embryo’s.

De mechanismen van invaginatie van het archenteron van elke soort werden bekeken aan de hand van vier factoren: Duwen van de vegetale cellen in de blastocoel door celgroei aan de dierlijke pool (Takata en Kominami, 2001), rek van de cellen die het archenteron vormen, herschikking van de cellen die het archenteron vormen langs de dierlijk-vegetale as en verharding van het darm rudiment door de filopodia van de SMC’s die vanaf de punt van het archenteron in de blastocoel zijn binnengedrongen (Ettensohn, 1985; Hardin, 1988; Dan en Okazaki, 1956; Gustafson en Kinnander, 1956; Tabel 2). Bij T. toreumaticus wordt de blastopore smal aan het einde van de invaginatie (Fig. 7B). De blastopore van Scaphechinus milabilis, die een continue invaginatie heeft, wordt smal rond het einde van de invaginatie (Kominami en Masui, 1996). Daarom suggereren wij dat het archenteron van T. toreumaticus ook kan verlengen door continue ingressie van de cellen rond de blastopore in de blastocoel. Bij onregelmatige zee-egels met continue invaginatie verandert de diameter van het archenteron tijdens de invaginatie niet, zodat de celherschikking geen invloed heeft op de verlenging van het archenteron (Kominami en Masui, 1996; Takata en Kominami, 2004). Wij stelden echter vast dat bij T. toreumaticus de diameter in het midden van het archenteron en de dikte van de wand van het archenteron snel afnamen. Het is mogelijk dat de herschikking en verlenging van de archenteroncellen de verlenging van het archenteron veroorzaakt. Bij T. toreumaticus en onregelmatige zee-egels beginnen en eindigen de vroege ontwikkelingsgebeurtenissen, waaronder het binnendringen van de PMC’s, het initiëren van de invaginatie van het archenteron, en de vorming van de SMC’s, in relatief vroege stadia. Dit suggereert dat de ontwikkelingsgebeurtenissen versneld en over het algemeen achterwege gelaten kunnen worden, en vervolgens betrokken zijn bij de voortdurende invaginatie van het archenteron. Bij deze soort vormden de SMC’s en de langgerekte filopodia zich tegen het einde van de invaginatie, wat betekent dat de SMC’s het archenteron mogelijk niet verharden. De uiteindelijke mate van invaginatie is ongeveer 94% (Fig. 5B) en de primaire poreuze kanalen van deze soort behouden niet de lichaamsbreedte (Kitazawa et al., 2014). Wij suggereren dat de continue invaginatie optreedt door verlenging van het archenteron zelf.

In T. reevesii nam de dikte van de archenteronwand af na de vertragingsperiode (Fig. 5C). Dit suggereert dat celverlenging de verlenging van het archenteron veroorzaakt. De diameter en dikte van de wand van het archenteron in het midden van het archenteron namen af. Dit suggereert dat een andere afname werd veroorzaakt door herschikking van de cellen in het archenteron (Fig. 8D,E). Het is mogelijk dat de SMC’s voor de verlenging van het archenteron zorgen, gezien de lange latentieperiode en periode voor secundaire invaginatie bij deze soort (Fig. 5C), en SMC’s filopodia vormden tijdens de secundaire invaginatie. Na de initiatie van de invaginatie werd de dikte van de archenteron tip alleen bij deze soort tijdelijk dun (data niet getoond).

In T. hardwickii nam de diameter van de blastopore af van het einde van de eerste invaginatie tot de initiatie van de secundaire invaginatie (Fig. 5D). Zoals bij S. milabilis (Kominami en Masui, 1996), suggereren de resultaten dat deze afname bij T. hardwickii veroorzaakt kan worden door groei aan de dierlijke pool die de cellen aan de vegetale pool voortduwt waardoor het archenteron langer wordt. De diameter in het midden van het archenteron nam af tijdens de achterblijvende periode (Fig. 8F), veroorzaakt door herschikking van de cellen van het archenteron langs de dierlijk-vegetale as. De dikte van de wand van het archenteron was constant (Fig. 8G) en dit kan betekenen dat de verlenging van het archenteron niet veroorzaakt wordt door celverlenging, maar door herschikking van de cellen. SMC’s met filopodia werden waargenomen tijdens secundaire invaginatie, en het is mogelijk dat de SMC’s de verlenging van het archenteron veroorzaken. Bij T. hardwickii eindigde de invaginatie echter op ongeveer 60% van de embryonale lengte en SMC’s werden pas tegen het einde van de invaginatie geïdentificeerd. Daarom is het mogelijk dat de SMC’s met filopodia geen verlenging van het archenteron veroorzaken, maar de punt van het archenteron bij het vermoedelijke orale gebied verharden.

In M. globulus werden de cellen van het archenteron dun vanaf het einde van de lagperiode tot de initiatie van de secundaire invaginatie (Fig. 8H,I). Takata en Kominami (2004) meldden dat bij M. globulus de herschikking niet opmerkelijk was. De top van het archenteron hechtte zich niet aan de apicale plaat, noch verspreidden zich SMCs in de blastocoel. Bovendien veranderde het aantal cellen van het archenteron niet. Daarom wordt gesuggereerd dat de verlenging van de cellen om het archenteron te vormen, de verlenging van het archenteron veroorzaakt. De diameter van de blastopore nam af tijdens de invaginatie (Fig. 7E), wat betekent dat het indrukken van de vegetale cellen door de groei van de dierlijke cellen de oorzaak kan zijn van de verlenging van het archenteron bij deze soort.

De vorming van SMC’s vond gelijktijdig plaats bij de vier bestudeerde temnopleuriden. De drie soorten met stapsgewijze invaginatie hadden echter een langere invaginatieperiode nodig dan de soorten met continue invaginatie en hun uiteindelijke invaginatieratio bedroeg ongeveer 60% (Fig. 5). Hun SMC’s vormden filopodia tijdens de late invaginatieperiode (Fig. 5) en het is mogelijk dat de SMC’s de richting van de verlenging van het archenteron naar het vermoedelijke mondgebied veranderen door de tip van het archenteron te verharden. Bovendien meldden Amemiya et al. (1982) dat de pseudopodia van de SMC’s het archenteron omhoog kunnen trekken bij H. pulcherrimus en P. depressus, maar niet bij A. crassispina omdat deze niet veel pseudopodia vormt.

De diameters aan de top van het archenteron wijzen op verschillende veranderingen bij de soorten (Fig. 9). Deze resultaten wijzen erop dat het kenmerk aan de top van het archenteron soortspecifieke invaginatie of het vormingsproces van de coelomische zakjes kan veroorzaken. Deze conclusie wordt ondersteund door bevindingen dat het vormingspatroon van het primaire poreuze kanaal van de coelomische pouches verschilt tussen deze soorten (Kitazawa et al., 2012, 2014).

Onze resultaten geven aan dat temnopleuriden soortspecifieke verschillen hebben tijdens de vroege morfogenese, inclusief blastula-vorming en invaginatie van het archenteron met inbegrip van effectieve factoren in dezelfde familie (Tabellen 1 en 2, Fig. 10). Temnopleurus toreumaticus ontwikkelt enkele soortspecifieke kenmerken zoals gerimpeld ei en gerimpelde blastula-vorming tijdens de vroege ontwikkelingsstadia (Kitazawa et al., 2009, 2010). Fylogenetische analyse op basis van allozymegegevens van temnopleuriden suggereert dat T. toreumaticus en T. reevesii nauwer verwant zijn dan T. hardwickii en M. globulus (Matsuoka en Inamori, 1996). Op basis van morfologische en moleculaire analyse stelden Jeffery et al. (2003) echter vast dat M. globulus en T. reevesii nauwer aan elkaar verwant zijn dan aan T. toreumaticus. Recentelijk hebben we ook de ontwikkeling van een andere temnopleuride, Temnotrema sculptum, waargenomen en deze soort lijkt sterk op T. reevesii, T. hardwickii en M. globulus, maar niet op T. toreumaticus (Fujii et al., 2015). Daarom stellen we de hypothese dat T. toreumaticus na divergentie meer soortspecifieke kenmerken in vroege ontwikkelingsstadia heeft ontwikkeld dan andere temnopleuriden. Het is echter nog niet duidelijk waarom de verschillen in morfogenese in de vroege ontwikkelingsstadia in deze groep geëvolueerd zijn, ook al vertonen deze soorten zeer gelijkaardige kenmerken, zoals ei-grootte, algemene ontwikkelingssnelheid, of larvale morfologie. Er is een mogelijkheid dat sommige verschillen in fundamentele geconserveerde ontwikkelingsgebeurtenissen in de vroege ontwikkelingsstadia tussen temnopleuriden accumuleren door toevallige drift, zolang ze de algemene ontwikkeling niet verstoren door drift van ontwikkelingssystemen zoals voorgesteld door True en Haag (2001).