Acetylocholinoesteraza jako biomarker w medycynie środowiskowej i zawodowej: New Insights and Future Perspectives
Abstract
Acetylocholinoesteraza (AChE) jest kluczowym enzymem w układzie nerwowym. Kończy impulsy nerwowe poprzez katalizowanie hydrolizy neuroprzekaźnika acetylocholiny. Jako specyficzny cel molekularny pestycydów fosforoorganicznych i karbaminianowych, aktywność acetylocholinoesterazy i jej inhibicja zostały wcześnie uznane za biologiczny marker zatrucia pestycydami. W ostatnich dwóch dekadach pomiar inhibicji AChE był coraz częściej stosowany w medycynie pracy i medycynie środowiskowej jako biomarker wpływu na układ nerwowy w następstwie narażenia na pestycydy fosforoorganiczne i karbaminianowe. Sukces tego biomarkera wynika z faktu, że spełnia on szereg cech niezbędnych do skutecznego zastosowania odpowiedzi biologicznej jako biomarkera w biomonitoringu człowieka: odpowiedź jest łatwa do zmierzenia, wykazuje zachowanie zależne od dawki w stosunku do ekspozycji na zanieczyszczenie, jest czuła i wykazuje związek z niekorzystnymi dla zdrowia efektami. Celem niniejszej pracy jest przegląd i omówienie najnowszych odkryć dotyczących acetylocholinoesterazy, w tym jej wrażliwości na inne zanieczyszczenia oraz ekspresji różnych wariantów splicingowych. Te spostrzeżenia otwierają nowe perspektywy dla przyszłego wykorzystania tego biomarkera w monitorowaniu środowiskowym i zawodowym zdrowia człowieka.
1. Wprowadzenie
Markery biologiczne (biomarkery) zostały wcześnie zdefiniowane jako „komórkowe, biochemiczne lub molekularne zmiany, które są mierzalne w mediach biologicznych, takich jak ludzkie tkanki, komórki lub płyny”. Ostatnio definicja ta obejmuje cechy biologiczne, które mogą być obiektywnie mierzone i oceniane jako wskaźniki normalnych procesów biologicznych, procesów patogennych lub odpowiedzi farmakologicznych na interwencję terapeutyczną.
Biomarkery są użytecznymi narzędziami w wielu dziedzinach, w tym w medycynie, zdrowiu środowiskowym, toksykologii, biologii rozwojowej i podstawowych badaniach naukowych. W ostatnich dwóch dekadach odnotowano rosnące zainteresowanie biomarkerami w medycynie pracy i medycynie środowiskowej, co zaobserwowano na rycinie 1, gdzie przedstawiono trend liczby prac opublikowanych w tych dziedzinach w ciągu ostatnich 20 lat. Zainteresowanie biomarkerami w medycynie pracy i medycynie środowiskowej jest zbieżne z rozwojem biomonitoringu człowieka, który definiuje się jako powtarzane, kontrolowane pomiary chemikaliów lub biomarkerów w płynach, tkankach lub innych dostępnych próbkach od osób obecnie narażonych, narażonych w przeszłości lub mających być narażonymi na chemiczne, fizyczne lub biologiczne czynniki ryzyka w miejscu pracy i/lub środowisku ogólnym. Biomonitoring człowieka jest cennym narzędziem w szacowaniu narażenia wybranych populacji i obecnie stosowany jest w programach nadzoru na całym świecie.
Liczba prac opublikowanych w ciągu ostatnich 20 lat. Badania przeprowadzono w serwisie Scopus, stosując dwa zapytania badawcze, odpowiednio: (1) „biomarker*” i „medycyna pracy”, (2) „biomarker*” i „medycyna środowiskowa” (Scopus, kwiecień 2013).
Biomarkery stosowane w środowiskowym i zawodowym monitorowaniu zdrowia człowieka można podzielić na trzy klasy: biomarkery narażenia, skutku i podatności . Biomarkery narażenia obejmują pomiar związku macierzystego, metabolitów i odzwierciedlają dawkę narażenia. Biomarkery skutku są mierzalnymi biochemicznymi, fizjologicznymi i behawioralnymi zmianami w organizmie, które mogą być rozpoznane jako związane z ustalonym lub możliwym uszczerbkiem na zdrowiu lub chorobą. Biomarkery podatności wskazują na wrodzoną lub nabytą zdolność organizmu do reagowania na określone narażenie.
W ciągu ostatnich dwóch dekad różnorodne biomarkery zostały wykorzystane do badania populacji pracowników, a badania te przyczyniły się na różnych poziomach do poprawy zdrowia w miejscu pracy. Na podstawie tego sukcesu istnieje ciągła potrzeba rozwoju i stosowania biomarkerów jako użytecznych narzędzi do wykrywania w czasie rzeczywistym narażenia na substancje niebezpieczne w miejscu pracy i w środowisku ogólnym.
Jednym z wczesnych biomarkerów scharakteryzowanych w narażeniu środowiskowym człowieka jest inhibicja enzymu acetylocholinoesterazy (AChE) jako biomarker wpływu na układ nerwowy w następstwie złożonego narażenia na związki fosforoorganiczne.
Prezentowana praca ma na celu przegląd i omówienie najnowszych wyników badań nad tym biomarkerem w odniesieniu do obecnego i przyszłego zastosowania w środowiskowym i zawodowym monitorowaniu zdrowia człowieka.
2. AChE: Cechy ogólne
AChE należy do rodziny cholinesteraz (ChE), które są wyspecjalizowanymi hydrolazami estrów karboksylowych rozkładającymi estry choliny. Klasa cholinesteraz obejmuje AChE, która hydrolizuje neuroprzekaźnik acetylocholinę oraz pseudocholinesterazę lub butyrylocholinesterazę (BChE), która wykorzystuje butyrylocholinę jako substrat. AChE występuje głównie w połączeniach nerwowo-mięśniowych i synapsach cholinergicznych w ośrodkowym układzie nerwowym. AChE hydrolizuje acetylocholinę do choliny i octanu po aktywacji receptorów acetylocholiny na błonie postsynaptycznej. Aktywność AChE służy do zakończenia transmisji synaptycznej, zapobiegając ciągłemu odpalaniu nerwów w zakończeniach nerwowych. Dlatego też jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. AChE znajduje się również na błonach czerwonych krwinek, gdzie stanowi antygen grupy krwi Yt, znany również jako Cartwright. Pomaga on w określeniu grupy krwi danej osoby, ale jego fizjologiczna funkcja na błonie erytrocytów jest do tej pory nieznana. BChE występuje w osoczu, a jego funkcja fizjologiczna we krwi pozostaje nadal nieznana .
Cząsteczka AChE składa się z dwóch różnych domen białkowych: dużej domeny katalitycznej o długości około 500 reszt i małego C-końcowego peptydu o długości mniejszej niż 50 reszt. AChE jest produktem pojedynczego genu, który w różnych tkankach ulega ekspresji w różnych formach splicingu. Alternatywny splicing w 3′ terminusie pre-mRNA AChE wytwarza trzy warianty: pierwotną, „synaptyczną” AChE-S (inaczej zwaną „ogoniastą” AChE-T), indukowaną stresem, rozpuszczalną (readthrough) AChE-R oraz erytrocytarną AChE-E . Izoformy te mają podobną domenę katalityczną, ale różnią się domeną C-końcową, która wpływa na ich formę molekularną i lokalizację oraz nadaje im specyficzne cechy. „Synaptyczna” AChE-S stanowi główny enzym multimeryczny w mózgu i mięśniach. Jest on typowo tetrameryczny i związany z błoną w synapsie. Rozpuszczalna, monomeryczna, „odczytywalna” AChE-R jest indukowana pod wpływem stresu chemicznego i fizycznego; erytrocytarna AChE-E jest dimerem związanym z glikofosfatydyloinozytolem (GPI-) skierowanym do błony plazmatycznej erytrocytów i limfocytów. AChE-S i AChE-R zostały opisane również w komórkach krwi obwodowej .
Miejsce aktywne AChE obejmuje dwa miejsca: anionowe i estrowe. Podmiejsce anionowe jest miejscem wiązania dodatniej czwartorzędowej aminy acetylocholiny. Podstrona estrowa jest miejscem, w którym acetylocholina jest hydrolizowana do octanu i choliny. Hydroliza estru karboksylowego prowadzi do powstania acylo-enzymu i wolnej choliny. Następnie acyl-enzym ulega nukleofilowemu atakowi cząsteczki wody, uwalniając kwas octowy i regenerując wolny enzym.
3. Związki fosforoorganiczne i karbaminianowe jako specyficzne inhibitory AChE
Pestycydy fosforoorganiczne i karbaminianowe są znanymi specyficznymi inhibitorami aktywności katalitycznej acelocholinoesterazy. Od czasu wycofania z użycia pestycydów chloroorganicznych stały się one najczęściej stosowanymi pestycydami. Związki fosforoorganiczne i karbaminianowe wiążą się ze zmiennym powinowactwem do miejsca estrowego, odpowiednio poprzez fosforylację lub dekarbamylację, i inaktywują enzym. Związki fosforoorganiczne są uważane za funkcjonalnie nieodwracalne inhibitory AChE, ponieważ czas potrzebny do uwolnienia enzymu z inhibicji może przekraczać czas potrzebny do syntezy nowej AChE. Karbaminiany, z drugiej strony, mają dość szybki etap dekarbamylacji, tak że znaczne odzyskanie enzymu może nastąpić w skończonym czasie. Szybkość hydrolizy pośredniej fosforylowanego lub karbaminowanego enzymu nie jest jedynym czynnikiem wpływającym na toksyczność tych pestycydów. Innym ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę jest powinowactwo grupy serynowo-hydroksylowej w miejscu aktywnym (miejsce estrowe) do inhibitora. Niektóre związki mają bezpośredni wpływ na enzym, podczas gdy inne, takie jak paration czy chloropiryfos, które mają niewielką zdolność do bezpośredniego hamowania AChE, są metabolicznie aktywowane przez cytochrom P450 tworząc silne inhibitory AChE określane jako „analogi tlenowe” lub „oksony”. Chociaż wiadomo, że te oksony hamują AChE poprzez fosforylację Ser-203, szczegóły interakcji pomiędzy tymi oksonami a enzymem są niejasne. Ostatnie wyniki sugerują, że interakcje oksonu chloropiryfosu z AChE są złożone i mogą obejmować wiązanie się tego oksonu z drugorzędnym miejscem na enzymie.
Pestycydy fosforoorganiczne i karbaminianowe są szeroko stosowane do zwalczania szkodników na uprawach w rolnictwie i na zwierzętach gospodarskich oraz do użytku domowego, w tym do zwalczania owadów w zastosowaniach domowych i ogrodowych. Pozostałości pestycydów fosforoorganicznych zostały wykryte na dopuszczalnych (a czasami niedopuszczalnych) poziomach w wielu produktach rolnych; dlatego też istnieje prawdopodobieństwo niskiego poziomu narażenia na pestycydy fosforoorganiczne w pożywieniu. Narażenie zawodowe występuje na wszystkich etapach formułowania, wytwarzania i produkcji pestycydów i wiąże się z narażeniem na złożone mieszaniny różnych rodzajów tych związków. Ogólnie rzecz biorąc, narażenie zawodowe na pestycydy fosforoorganiczne jest mniejsze niż narażenie środowiskowe; jednakże, specjalne populacje, takie jak dzieci pracujące na farmach, mogą być narażone w większym stopniu. Duże ilości tych związków są uwalniane do środowiska, a wiele z nich działa również na organizmy niebędące celem ich działania, stanowiąc potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzi i środowiska. Pozostałości fosforoorganiczne i karbaminianowe pochodzące z praktyk rolniczych są w stanie przeniknąć przez glebę do wód powierzchniowych ze względu na ich rozpuszczalność w wodzie. W wyniku ich szerokiego rozprzestrzeniania się tam, pozostałości zostały wykryte w żywności, wodzie gruntowej i pitnej, naturalnych wodach powierzchniowych i organizmach morskich. Dlatego wszyscy ludzie są nieuchronnie narażeni na działanie tych związków i/lub produktów ich rozkładu poprzez zanieczyszczenie środowiska lub ich zawodowe zastosowanie w powietrzu, wodzie i żywności. Zanieczyszczenia te nie mogą być łatwo wykryte za pomocą analizy chemicznej ze względu na ich stosunkowo krótki czas życia w środowisku; z drugiej strony ich produkty degradacji środowiskowej mogą być bardzo szkodliwe, zachowując aktywność antycholinesterazową.
Jak ostatnio przedstawili Black i Read, hamowanie AChE przez związki fosforoorganiczne budzi pewne zainteresowanie również w związku z problemem narażenia na chemiczne środki bojowe, takie jak fosforoorganiczne środki nerwowe. Są to najbardziej toksyczne chemiczne środki bojowe, o których wiadomo, że zostały wyprodukowane, zmagazynowane i uzbrojone. Ich opracowywanie, produkcja, składowanie i stosowanie są zabronione na mocy konwencji o zakazie broni chemicznej i wraz z ich prekursorami podlegają ścisłej kontroli i procedurom weryfikacji. Pierwsze potwierdzone użycie fosforoorganicznych środków nerwowych w działaniach wojennych miało miejsce w Iraku podczas konfliktu z Iranem (Organizacja Narodów Zjednoczonych, 1984 r.) oraz w Iraku przeciwko ludności kurdyjskiej. Niedawno zauważono zwiększone ryzyko użycia środków nerwowych przez niektóre grupy terrorystyczne.
4. Inhibicja AChE jako biomarker efektu w medycynie zawodowej i środowiskowej
Jako cel molekularny związków fosforoorganicznych i karbaminianów, pomiar AChE we krwi został wcześnie uznany za biologiczny marker efektu tych cząsteczek u ludzi i stał się narzędziem diagnostycznym w dziedzinie biomedycyny. Jak zaobserwowano na rycinie 2 w ostatnich dwóch dekadach obserwuje się rosnące zainteresowanie AChE jako biomarkerem w medycynie pracy i medycynie środowiskowej, na co wskazuje rosnąca liczba prac z tych dziedzin.
Liczba prac opublikowanych w ciągu ostatnich 20 lat. Badania przeprowadzono w serwisie Scopus, stosując dwa zapytania badawcze, odpowiednio: (1) „AChE” i „medycyna pracy”, (2) „AChE” i „medycyna środowiskowa” (Scopus, kwiecień 2013).
Dzisiaj pomiar poziomu ChE we krwi jest konwencjonalną metodą oceny stopnia narażenia zawodowego na pestycydy fosforoorganiczne w środowiskach narażonych (np. środowiskach związanych z produkcją i stosowaniem pestycydów) podczas okresowego ustawowego nadzoru medycznego w kilku krajach . Poziomy interwencji zostały ustalone, na przykład w Szwecji: jeśli zahamowanie AChE (obliczone w odniesieniu do indywidualnego poziomu przedekspozycyjnego – linii podstawowej) wynosi 25%, należy przeprowadzić drugi pomiar. Jeśli spadek aktywności AChE zostanie potwierdzony, należy unikać ekspozycji przez 14 dni.
Pomiar cholinoesterazy we krwi jest również przydatny jako podstawowy biomarker w medycynie ratunkowej w przypadkach zatruć i przypadkowego narażenia na fosforoorganiczne lub karbaminianowe. W medycynie pracy i medycynie środowiskowej erytrocyt AChE i osocze lub surowica BChE są dwoma głównymi typami ChE mierzonymi we krwi. Potencjalna inhibicja AChE i BChE różni się znacznie w zależności od różnych związków fosforoorganicznych. Niektóre pestycydy fosforoorganiczne hamują BChE silniej niż AChE. Inhibicja BChE jest silnie skorelowana z intensywnością i czasem trwania wyższej ekspozycji na dużą grupę pestycydów fosforoorganicznych i karbaminianowych. Hamowanie BChE nie odzwierciedla jednak biologicznych efektów działania fosforoorganicznych pestycydów w układzie nerwowym. Z drugiej strony inhibicja AChE jest bardziej wrażliwa niż BChE w przypadku przewlekłej ekspozycji na fosforoorganiczne pestycydy. W rzeczywistości, inhibicja AChE przez organofosfat wykazuje niższą szybkość odzyskiwania w porównaniu do BChE, co powoduje kumulacyjny efekt hamujący aktywność AChE. W przeciwieństwie do BChE, hamowanie AChE w erytrocytach odzwierciedla biologiczne efekty działania fosforoorganicznego w układzie nerwowym. W związku z tym, pomiary AChE w czerwonych krwinkach są ogólnie preferowane w stosunku do pomiarów aktywności ChE w osoczu, ponieważ dane dotyczące czerwonych krwinek mogą zapewnić lepszą reprezentację hamowania neuronalnej AChE.
Sukces wykorzystania inhibicji AChE jako biomarkera efektu narażenia na fosforoorganiczne wynika z faktu, że spełnia ona szereg cech niezbędnych do pomyślnego zastosowania odpowiedzi biologicznej jako biomarkera w biomonitoringu: odpowiedź jest łatwa do zmierzenia, wykazuje zachowanie zależne od dawki w stosunku do narażenia na zanieczyszczenie, jest wrażliwa i wykazuje związek z niekorzystnymi dla zdrowia skutkami.
Najpowszechniej stosowaną metodą pomiaru aktywności AChE we krwi jest metoda Ellmana oparta na fotometrycznym oznaczaniu produktu chromogennego pochodzącego z reakcji pomiędzy acetylo-tiocholiną (substratem enzymu) a kwasem 5, 5-ditiobis-2-nitrobenzoesowym (DTNB, odczynnik Ellmana). Metoda ta jest łatwa w użyciu, wykorzystuje stosunkowo niedrogi sprzęt, a wyniki są dokładne i ilościowe. W ostatnim czasie badane są również właściwości inhibicji AChE w ślinie ludzkiej jako biomarkera działania pestycydów fosforoorganicznych. W ostatnich latach gwałtownie wzrosło wykorzystanie śliny jako płynu diagnostycznego do opracowywania biomarkerów. Wykorzystanie śliny do wykrywania biomarkerów ma wiele zalet: pobieranie śliny jest nieinwazyjne w porównaniu do pobierania krwi, jest bardziej akceptowalne przez pacjentów i nie niesie ze sobą ryzyka zranienia igłą. Te cechy sprawiają, że ślina jest odpowiednia do nadzoru medycznego i monitorowania biologicznego. AChE w ślinie ludzkiej pochodzi z komórek gruczołów ślinowych, podczas gdy BChE może pochodzić z mikroorganizmów w jamie ustnej. Sayer i wsp. wykazali, że aktywność katalityczna AChE w ślinie jest stabilna w temperaturze pokojowej do 6 h. W grupie narażonych na działanie pestycydów pracowników fabryki, aktywność cholinoesterazy w ślinie była niższa niż w zdrowych grupach kontrolnych. Henn i wsp. zasugerowali, że ślina może być użytecznym wskaźnikiem potencjalnych efektów neurotoksycznych wynikających z ekspozycji na pestycydy fosforoorganiczne i karbaminianowe, ale wskazali na potrzebę dalszego badania czynników wpływających na wysoką zmienność pomiarów w porównaniu z pomiarami AChE we krwi. W badaniu Ng i wsp. zakwestionowano wykorzystanie AChE w ślinie jako biomarkera dla związków fosforoorganicznych ze względu na niski poziom AChE w ślinie w stosunku do erytrocytów oraz słabą korelację pomiędzy tymi dwoma pomiarami. W związku z tym, wykorzystanie pomiaru AChE jako biomarkera działania zamiast pomiaru we krwi pozostaje nadal przedmiotem dyskusji.
Użycie biomarkera w biomonitoringu wymaga znajomości zależności pomiędzy narażeniem na działanie substancji chemicznych, reakcjami biomarkera i niekorzystnymi skutkami. Aspekty te zostały dobrze poznane w przypadku AChE. W kilku badaniach wykazano istotny związek między narażeniem na związki fosforoorganiczne a inhibicją AChE w narażonych populacjach pracowników. Jeśli chodzi o związek pomiędzy zahamowaniem AChE a negatywnymi skutkami zdrowotnymi, wiadomo, że zahamowanie AChE pomiędzy 50% a 60% wywołuje wzorzec dawka-odpowiedź w postaci stosunkowo łagodnych objawów, takich jak osłabienie, ból głowy, zawroty głowy, nudności i ślinotok z rekonwalescencją trwającą 1-3 dni (rysunek 3). Zahamowanie AChE pomiędzy 60 a 90% powoduje umiarkowane objawy, takie jak pocenie się, wymioty, biegunka, drżenia, zaburzenia chodu, ból w klatce piersiowej i sinica błon śluzowych, które ustępują w ciągu kilku tygodni. Przy 90-100% zahamowaniu dochodzi do śmierci z powodu niewydolności oddechowej lub krążeniowej .
Zależność pomiędzy zahamowaniem AChE a negatywnymi skutkami zdrowotnymi. Sporządzono na podstawie wyników badań Maroni i wsp.
5. Wrażliwość AChE na inne zanieczyszczenia
W ostatnich latach coraz częściej zgłaszano u ludzi i innych zwierząt hamowanie AChE przez kilka gatunków chemicznych innych niż pestycydy fosforoorganiczne i karbaminianowe, w tym metale ciężkie, inne pestycydy, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, detergenty i składniki złożonych mieszanin zanieczyszczeń.
Potencjał niektórych jonów metali, takich jak Hg2+, Cd2+, Cu2+ i Pb2+, do obniżania aktywności AChE w warunkach in vitro i/lub in vivo został wykazany w kilku badaniach na ludziach i zwierzętach. Ademuyiwa i wsp. badali potencjalny wpływ ołowiu na aktywność AChE erytrocytów podczas ekspozycji zawodowej na ten metal i zasugerowali, że aktywność AChE erytrocytów może być wykorzystana jako biomarker neurotoksyczności wywołanej ołowiem u osób narażonych zawodowo.
Na aktywność AChE mogą również wpływać inne pestycydy z różnych rodzin chemicznych, takie jak pyretroidy, triazyny i parakwat. Hernández i wsp. zasugerowali przydatność AChE jako biomarkera narażenia w nadzorowaniu pracowników długotrwale narażonych na pestycydy inne niż fosforoorganiczne i karbaminianowe.
Wiele wyników badań wskazuje również na antycholinesterazowy efekt wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, które są powszechnym zanieczyszczeniem środowiska w wodach powierzchniowych, osadach, glebie i powietrzu miejskim. Związki te powstają podczas niecałkowitego spalania paliw kopalnych, drewna, spalania odpadów komunalnych, z silników spalinowych. Kang i Fang wykazali, że kilka wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych hamuje AChE bezpośrednio in vitro. Wielkość inhibicji różni się wśród badanych związków i może być związana z liczbą pierścieni aromatycznych w cząsteczce. Co ciekawe, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne są w stanie hamować aktywność AChE w sposób addytywny wraz z organofosforanami, będąc niekompetycyjnymi inhibitorami AChE .
Ostatnio, ze względu na rosnące zainteresowanie nanomateriałami w różnych zastosowaniach (np. elektronika, biomedycyna, kataliza, materiałoznawstwo), Wang i wsp. zbadali potencjalny wpływ nanocząstek na aktywność AChE in vitro. Różne klasy nanocząstek, w tym metale, tlenki i nanorurki węglowe (SiO2, TiO2, Al2O3, Al, Cu, miedź powlekana węglem, wielościenne nanorurki węglowe i jednościenne nanorurki węglowe), wykazywały wysokie powinowactwo do AChE. Cu, Cu-C, wielościenne nanorurki węglowe oraz jednościenne nanorurki węglowe MWCNT, SWCNT wykazywały zależne od dawki hamowanie aktywności AChE z wartościami IC50 wynoszącymi odpowiednio 4, 17, 156 i 96 mgL-1. Hamowanie przez nanocząstki było głównie spowodowane adsorpcją lub interakcją z enzymem .
Wszystkie te odkrycia dotyczące wrażliwości AChE na kilka klas zanieczyszczeń innych niż związki fosforoorganiczne i karbaminianowe muszą być wzięte pod uwagę w celu właściwego zastosowania tego biomarkera w medycynie środowiskowej i zawodowej. W rzeczywistości w większości przypadków obserwuje się narażenie mieszane. Warto zauważyć, że nie tylko różne związki mogą osiągać poziomy istotności pod względem działania antycholinesterazowego, ale również kombinacje różnych klas chemicznych mogą wywierać addytywny lub synergistyczny efekt hamujący na aktywność AChE. Sugeruje to potrzebę ponownego rozważenia możliwości zastosowania AChE w biomonitoringu i ocenie ryzyka na obszarach zanieczyszczonych kilkoma klasami zanieczyszczeń. W takich przypadkach przydatność tego biomarkera mogłaby polegać na dostarczeniu zintegrowanego pomiaru całkowitego ryzyka neurotoksycznego stwarzanego przez cały ładunek biodostępnych zanieczyszczeń obecnych w środowisku.
6. Niekatalityczne funkcje AChE i wrażliwość na organofosforany
Badania ostatnich dwudziestu lat wskazują na dodatkowe funkcje AChE poza jej aktywnością katalityczną i rolą w kończeniu neurotransmisji w synapsach cholinergicznych. Wykazano, że różne izoformy AChE wpływaj± na proliferację komórek, ich różnicowanie i odpowiedzi na różne stresy. AChE wydaje się odgrywać ważną rolę w rozwoju aksonalnym, synaptogenezie, adhezji komórek, migracji neuronów, odpowiedzi na stres hemopoetyczny i apoptozie. Funkcje te są w dużej mierze niezależne od enzymatycznej zdolności do hydrolizy acetylocholiny. Mechanizmy leżące u podstaw tych ważnych funkcji niekatalitycznych są do zbadania; jednak wydaje się, że obejmują one alternatywnie splicowane warianty AChE w kilku tkankach.
Wiadomo, że liczne bodźce stresowe wiążą się ze zwiększonym stosunkiem między AChE-R i AChE-S w mózgu i komórkach krwi .
W mózgu AChE-S jest główną izoformą w warunkach fizjologicznych, ale normalnie rzadki wariant AChE-R może wystąpić po ekspozycji na stres fizyczny lub leki antycholinesterazowe . Ogólnie rzecz biorąc, w normalnych warunkach, czynniki splicingowe SC35 i ASF/SF2 równoważą się wzajemnie i regulują splicing AChE, podnosząc poziom formy AChE-S i obniżając poziom formy AChE-R. Podczas stresu, SC35 indukuje nierównowagę dynamicznego stosunku wariantów AChE-S/R, przesuwając splicing formy AChE-S do formy AChE-R poprzez interakcję ze specyficznym egzonicznym wzmacniaczem splicingu.
Dwa warianty splicingowe AChE, R i S, pełnią różne funkcje w rozwoju i naprawie mózgu: izoforma AChE-R, preferencyjnie indukowana przez uraz, wydaje się promować naprawę i chronić przed neurodegeneracją, podczas gdy nadekspresja bardziej obfitej izoformy synaptycznej, AChE-S, zwiększa podatność na neurotoksyczność.
Ostatnio Jameson i wsp. zasugerowali, że nieenzymatyczne funkcje wariantów splice AChE są celem dla rozwojowej neurotoksyczności fosforoorganicznych. Jak wykazano na modelach zwierzęcych, związki fosforoorganiczne są w stanie wywołać neurotoksyczność rozwojową w dawkach, które nie wywołują żadnych objawów zatrucia ogólnoustrojowego, a nawet przy narażeniu poniżej progu hamowania AChE. U ludzi zaobserwowano powiązania między narażeniem na organofosforany w czasie ciąży a deficytami we wzroście płodu i rozwoju neurokognitywnym u dzieci. Wyniki te doprowadziły w niektórych krajach do ograniczenia stosowania niektórych insektycydów fosforoorganicznych w gospodarstwach domowych. Jednak mechanizmy i konsekwencje neurotoksyczności rozwojowej wywołanej przez fosforoorganiczne środki owadobójcze pozostają głównym problemem środowiskowym.
Organofosforany są znane z tego, że zwiększają ogólną ekspresję AChE i zmieniają względną ekspresję AChE-R i AChE-S w mózgu dorosłego ssaka. Z drugiej strony, w okresie rozwoju, ekspozycje na organofosforany wywołują wzór AChE związany z postępującą neurotoksycznością charakteryzującą się koindukcją zarówno AChE-R i AChE-S przy stężeniach ekspozycji poniżej progu hamowania aktywności katalitycznej AChE. Jak wskazali Jameson i wsp. , warianty AChE mogą uczestniczyć i być predykcyjne dla względnej neurotoksyczności rozwojowej fosforoorganicznych, w tym długoterminowych zaburzeń poznawczych.
Ostatnio stwierdzono, że narażenie na organofosforany wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia choroby Alzheimera u pracowników narażonych na te związki, a ponadto ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia choroby Alzheimera u dzieci. Na podstawie badania Darreh-Shori et al., którzy zbadali role dwóch wariantów AChE w chorobie Alzheimera, można wysunąć hipotezę o zaangażowaniu różnych izoform AChE w skojarzeniu fosforoorganicznym z chorobą Alzheimera u osób narażonych.
Interesująco, wszystkie te wyniki wskazują na potrzebę analizy wariantów splice genu AChE, które mogą być ważne w mechanizmach lub wynikach neurotoksyczności rozwojowej wywołanej przez organofosfory, a nie tylko całkowitej aktywności produktu białkowego. Ponadto, otwierają one nowe perspektywy dla potencjalnego wykorzystania ekspresji genów AChE w biomonitoringu i ocenie ryzyka. W perspektywie, badanie wariantów splicingowych genu AChE, ich funkcji oraz wywołanych zanieczyszczeniami zmian w ich ekspresji może przyczynić się do (1) wykrycia narażenia na stężenia zanieczyszczeń, które nie wywołują żadnych objawów zatrucia ogólnoustrojowego i zahamowania AChE u dorosłych, ale są w stanie wywołać długotrwałe skutki na etapach rozwojowych; (2) określenia nowych progowych poziomów narażenia, które chronią organizm przed niekorzystnymi skutkami na wszystkich etapach życia; (3) scharakteryzowania nowych biomarkerów podatności.
7. Wnioski
AChE jest jednym z pierwszych zatwierdzonych biomarkerów w medycynie środowiskowej i zawodowej, a jego zastosowanie wzrosło w ciągu ostatnich dwóch dekad. Jednakże, ostatnie odkrycia wskazują na nowe możliwości AChE w biomonitoringu człowieka. Wrażliwość aktywności AChE na inne klasy chemikaliów, w tym nowe zanieczyszczenia, takie jak nanomateriały, sugeruje przydatność tego biomarkera do zapewnienia zintegrowanego pomiaru całkowitego ryzyka neurotoksycznego wynikającego z całego obciążenia biodostępnymi zanieczyszczeniami w obszarach zanieczyszczonych kilkoma klasami zanieczyszczeń. Co więcej, badanie ekspresji wariantów splice AChE, ich roli w neurotoksyczności fosforoorganicznych, przyczynia się do rozwoju ekspresji genu AChE jako nowego biomarkera podatności, aby poprawić zrozumienie zdrowia środowiskowego i zawodowego.