Chromatografia papierowa

Papier zawieszony jest w naczyniu, w którym znajduje się płytka warstwa odpowiedniego rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników. Ważne jest, aby poziom rozpuszczalnika znajdował się poniżej linii, na której znajdują się plamki. Na następnym schemacie nie pokazano szczegółów dotyczących sposobu zawieszenia papieru, ponieważ istnieje zbyt wiele możliwych sposobów wykonania tej czynności, co powoduje zaśmiecenie schematu. Czasami papier jest po prostu zwinięty w luźny cylinder i przymocowany spinaczami na górze i na dole. Cylinder stoi wtedy po prostu na dnie pojemnika.

Powodem przykrycia pojemnika jest upewnienie się, że atmosfera w zlewce jest nasycona parami rozpuszczalnika. Nasycenie atmosfery w zlewce parą powstrzymuje rozpuszczalnik przed odparowaniem, gdy unosi się on w górę papieru.

Jak rozpuszczalnik powoli przemieszcza się w górę papieru, różne składniki mieszanin tuszu przemieszczają się z różną prędkością i mieszaniny są rozdzielane na różnokolorowe plamy.

Schemat pokazuje, jak może wyglądać płytka po tym, jak rozpuszczalnik przesunie się prawie do samej góry.

Z końcowego chromatogramu można dość łatwo zauważyć, że pióro, które napisało wiadomość, zawierało te same barwniki co pióro 2. Można również zauważyć, że pióro 1 zawiera mieszaninę dwóch różnych niebieskich barwników – jeden z nich może być taki sam jak pojedynczy barwnik w piórze 3.

WartościRf

Niektóre związki w mieszaninie przemieszczają się prawie tak daleko jak rozpuszczalnik; niektóre pozostają znacznie bliżej linii podstawowej. Odległość przebyta w stosunku do rozpuszczalnika jest stała dla danego związku, o ile wszystko inne jest stałe – na przykład rodzaj papieru i dokładny skład rozpuszczalnika.

Odległość przebyta w stosunku do rozpuszczalnika nazywana jest wartością Rf. Dla każdego związku można ją obliczyć za pomocą wzoru:

Na przykład, jeśli jeden składnik mieszaniny przebył odległość 9,6 cm od linii podstawowej, podczas gdy rozpuszczalnik przebył odległość 12.0 cm, wówczas wartość Rf dla tego składnika wynosi:

W przykładzie, który oglądaliśmy z różnymi piórami, nie było konieczne mierzenie wartości Rf, ponieważ dokonujesz bezpośredniego porównania po prostu patrząc na chromatogram.

Przyjmujesz założenie, że jeśli masz dwie plamki w końcowym chromatogramie, które są tego samego koloru i przebyły tę samą odległość w górę papieru, to najprawdopodobniej są one tym samym związkiem. Oczywiście nie jest to koniecznie prawdą – możesz mieć dwa podobnie zabarwione związki o bardzo podobnych wartościach Rf. Przyjrzymy się, jak można obejść ten problem w dalszej części strony.

A co, jeśli substancje, którymi jesteś zainteresowany, są bezbarwne?

W niektórych przypadkach może być możliwe uczynienie plamek widocznymi poprzez reakcję z czymś, co wytwarza barwny produkt. Dobrym tego przykładem są chromatogramy otrzymane z mieszanin aminokwasów.

Załóżmy, że masz mieszaninę aminokwasów i chcesz się dowiedzieć, jakie konkretnie aminokwasy zawierała ta mieszanina. Dla uproszczenia przyjmiemy, że wiesz, że mieszanina może zawierać tylko pięć z powszechnie występujących aminokwasów.

Niewielka kropla roztworu mieszaniny jest umieszczana na linii bazowej papieru, a podobne małe plamki znanych aminokwasów są umieszczane obok niej. Następnie papier umieszcza się w odpowiednim rozpuszczalniku i pozostawia do rozwinięcia jak poprzednio. Na diagramie mieszaniną jest M, a znane aminokwasy są oznaczone od 1 do 5.

Położenie czoła rozpuszczalnika jest zaznaczone ołówkiem, a chromatogram jest pozostawiony do wyschnięcia, a następnie spryskany roztworem ninhydryny. Ninhydryna reaguje z aminokwasami, dając barwne związki, głównie brązowe lub fioletowe.

Lewy diagram przedstawia papier po tym, jak czoło rozpuszczalnika prawie dotarło do góry. Plamki są jeszcze niewidoczne. Drugi schemat pokazuje, jak może wyglądać po spryskaniu ninhydryną.

Nie ma potrzeby mierzenia wartości Rf, ponieważ można łatwo porównać plamy w mieszaninie z plamami znanych aminokwasów – zarówno na podstawie ich położenia, jak i kolorów.

W tym przykładzie, mieszanina zawiera aminokwasy oznaczone jako 1, 4 i 5.

A co jeśli mieszanina zawierałaby aminokwasy inne niż te, których użyliśmy do porównania? W mieszaninie pojawiłyby się plamki, które nie pasowałyby do tych ze znanych aminokwasów. Musiałbyś powtórzyć eksperyment używając innych aminokwasów do porównania.

Dwukierunkowa chromatografia papierowa

Dwukierunkowa chromatografia papierowa omija problem oddzielania substancji, które mają bardzo podobne wartości Rf.

Powrócę do mówienia o barwnych związkach, ponieważ dużo łatwiej jest zobaczyć, co się dzieje. Można to doskonale zrobić ze związkami bezbarwnymi – ale trzeba użyć sporo wyobraźni w wyjaśnieniu, co się dzieje!

Tym razem chromatogram wykonuje się zaczynając od pojedynczej plamki mieszaniny umieszczonej na jednym końcu linii podstawowej. Jest ona umieszczona w rozpuszczalniku, tak jak poprzednio, i pozostawiona do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do górnej krawędzi papieru.

Na wykresie zaznaczono ołówkiem położenie czoła rozpuszczalnika, zanim papier wyschnie. Oznaczone jest ono jako SF1 – czoło rozpuszczalnika dla pierwszego rozpuszczalnika. Będziemy używać dwóch różnych rozpuszczalników.

Jeśli przyjrzysz się uważnie, możesz zauważyć, że duża centralna plamka na chromatogramie jest częściowo niebieska, a częściowo zielona. Dwa barwniki w mieszaninie mają prawie takie same wartości Rf. Równie dobrze, oczywiście, oba mogły mieć ten sam kolor – w takim przypadku nie można stwierdzić, czy w tej plamce był obecny jeden czy więcej barwników.

To, co teraz należy zrobić, to poczekać, aż papier całkowicie wyschnie, a następnie obrócić go o 90° i ponownie wywołać chromatogram w innym rozpuszczalniku.

Jest bardzo mało prawdopodobne, że dwie mylące się plamki będą miały takie same wartości Rf w drugim rozpuszczalniku, jak i w pierwszym, a więc plamki przesuną się o inną wartość.

Następny diagram pokazuje, co może się stać z różnymi plamkami na oryginalnym chromatogramie. Zaznaczone jest również położenie czoła drugiego rozpuszczalnika.

Nie zobaczysz oczywiście tych plamek w ich pierwotnym i końcowym położeniu – one się przesunęły! Końcowy chromatogram wyglądałby tak:

Chromatografia dwukierunkowa całkowicie rozdzieliła mieszaninę na cztery wyraźne plamki.

Jeśli chcesz zidentyfikować plamki w mieszaninie, oczywiście nie możesz tego zrobić z substancjami porównawczymi na tym samym chromatogramie, jak widzieliśmy wcześniej na przykładzie piór lub aminokwasów. Skończyłoby się na bezsensownej plamce.

Możesz jednak obliczyć wartości Rf dla każdej plamki w obu rozpuszczalnikach, a następnie porównać je z wartościami, które zmierzyłeś dla znanych związków w dokładnie tych samych warunkach.

Jak działa chromatografia papierowa?

Chociaż chromatografia papierowa jest prosta do wykonania, jest dość trudna do wyjaśnienia w porównaniu z chromatografią cienkowarstwową. Wyjaśnienie zależy w pewnym stopniu od tego, jakiego rozpuszczalnika używasz, a wiele źródeł całkowicie pomija ten problem. Jeśli jeszcze tego nie zrobiłeś, byłoby pomocne, gdybyś przeczytał wyjaśnienie jak działa chromatografia cienkowarstwowa (link poniżej). To zaoszczędzi mi wielu powtórzeń, a ja będę mógł skupić się na problemach.