PMC
Caso
Uma mulher de 44 anos começou a usar L-TRP (1500 mg diários) para insónia em Janeiro de 2009. Tinha sido submetida a uma cirurgia duodenal de emagrecimento em 2007 por obesidade, e durante os 12 meses seguintes perdeu 140 lbs de peso. Ela consumiu L-TRP, vendido sob o nome comercial “Uber rest” distribuído pela Heartland Products, que comprou a um boticário de Chicago. Para além da L-TRP, também utilizou L-carnitina, óleo de linho e ácido alfa-lipóico, mas não tomou nenhum medicamento. Nas três semanas seguintes ao início da L-TRP, desenvolveu inchaço nas extremidades superior e inferior, seguido de mialgia e fraqueza graves. Durante as quatro semanas seguintes, observou endurecimento progressivo da pele nas extremidades superiores e inferiores, mas poupando os dedos das mãos e dos pés. O exame físico em Agosto de 2009 foi notável pela induração lenhosa dos antebraços e pernas (Fig. 1A). A palpação das extremidades proximais provocou mialgias. Os testes musculares manuais revelaram força de grau 4/5 do Medical Research Council nos músculos das extremidades proximais superior e inferior com força distal normal. Os exames do nervo craniano, sensoriais e reflexos foram normais.
A. Mostra-se endurecimento da pele e edema no braço esquerdo e também estava presente tanto nas extremidades superiores como inferiores com fáscia palpavelmente espessada. B. Imagens de ressonância magnética axial Imagens de sequência STIR da coxa revelaram uma elevada intensidade de sinal na fáscia que envolve os músculos do compartimento anterior e posterior (setas). C. Tomografia computorizada do tórax de alta resolução mostrando alterações de vidro moído e opacidade do espaço aéreo no pulmão esquerdo (seta).
A investigação laboratorial demonstrou uma contagem elevada de glóbulos brancos (leucócitos) com 24% de eosinófilos (contagem absoluta de 1600 células/mm3). O soro aldolase estava ligeiramente elevado, mas a creatina cinase (CK) estava normal. Os resultados dos seguintes testes foram negativos ou normais: anti-nuclear, ADN de cadeia dupla, anti-neutrofílica citoplasmática, anti-Ro, anti-La, anti-Scl-70 e anti-CCP, factor reumatóide, taxa de sedimentação de eritrócitos, imunofixação sérica, hormona estimulante da tiróide, e albumina. Os estudos de condução nervosa (NCS) revelaram respostas motoras e sensoriais normais nas extremidades superiores e inferiores. A electromiografia (EMG) dos músculos proximais mostrou evidências sob a forma de pequena amplitude, curta duração, potenciais de unidade motora polifásica com recrutamento precoce para suportar a presença de um processo miopático. A ressonância magnética (MRI) das coxas mostrou edema muscular e fascial (Fig. 1B). A tomografia computorizada de alta resolução (TCAR) do tórax revelou opacificação de vidro moído no pulmão esquerdo (Fig. 1C). Biópsias da pele, vasta fáscia lateral, e músculo tomadas antes do início da imunoterapia mostraram alterações histopatológicas características da EMS (Fig. 2). Imuno-coloração com anticorpos aos produtos de desgranulação dos eosinófilos principais proteínas básicas (MBP) e neurotoxinas derivadas de eosinófilos (EDN) foram fortemente positivas (Figs. 2 H,I). A tipagem HLA-DR revelou que o doente tinha o alelo HLA-DRB1*04, um factor de risco entre os utilizadores de L-TRP para o desenvolvimento de EMS (OR 3,9, 95% CI 1,1-16,4), e a ausência de qualquer um dos alelos de protecção HLA relatados.12
Exemplos de biópsia de pele (A) e músculo (B – I) corados com hematoxilina e eosina (A – F), tricromio de Gomori (G), e anticorpos para neurotoxina derivada de eosinófilos (EDN) (H) e proteína básica principal (MBP) (I). A. Fibrose cutânea com acumulação de colagénio dérmico e infiltração de eosinófilos (seta). B. Fáscia e amostra muscular demonstra fibrose densa da fáscia epidérmica (seta escura) e fascículos atróficos do músculo (seta branca). C. Ampliação de maior potência revela fibras necróticas dispersas (flecha). D – G. Infiltrado inflamatório (setas) no tecido conjuntivo perimiliano (D), tecido conjuntivo endomísio (E), em torno do nervo intramuscular (F), e em torno dos vasos sanguíneos intramusculares (G). Os eosinófilos só raramente foram detectados. H, I. Análise de imunofluorescência. A coloração EDN (H) e MBP (I) está presente no tecido conjuntivo perimisial e endomísio, bem como em torno de vasos sanguíneos intramusculares e nervos (não mostrado).
Embora a L-TRP consumida antes do início dos sintomas já não estivesse disponível, várias amostras contemporâneas do mesmo lote foram submetidas a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com espectrometria de massa.13 Não foram detectadas impurezas superiores a 10 ppm em nenhuma das amostras. Em particular, o pico C (EBT), pico E (PAA), pico E (PAA), pico FF 2-(2-hidroxi indolina)-Trp, ou 2-(3-indolil)-L-triptofano não foram detectados (dados não mostrados).
Com o consentimento informado aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Northwestern University, uma única biópsia da pele perfurada de 3 mm foi retirada do antebraço clinicamente afectado para análise de microarranjo. Na altura da biopsia, o paciente estava a tomar prednisona (50 mg/d) e micofenolato mofetil (1000 mg/bid). A homogeneização da biopsia de pele ocorreu num Qiagen TissueLyser e o RNA total foi isolado utilizando RNeasy para kits de tecido de fibrose com automatização no Qiagen QIAcube. O RNA rotulado da pele lesional foi hibridizado competitivamente para 44.000 microarrays de oligonucleótidos Agilent representando 33.000 genes humanos conhecidos e novos.14 As amostras foram analisadas em triplicado e comparadas com três sítios anatómicos independentes e biópsias de pele de controlo feminino saudáveis, de acordo com a idade. Dados crus de microarrays foram depositados no National Center for Biotechnology Information’s Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo); número de adesão: GSE26934. Os genes diferentemente expressos entre os controlos saudáveis e as biópsias de pele EMS foram identificados usando Análise de Significância de Microarrays (SAM). Uma comparação da expressão genética na biópsia cutânea do SME com a dos controlos (Fig. 3) identificou 343 genes cuja expressão variou significativamente (SAM, taxa de falsas descobertas ≤ 0,64%). Os genes com expressão aumentada na biópsia do SME incluíam múltiplos colagénios (Colagénio V, Colagénio VI, Colagénio VIII, Colagénio XII), moléculas de matriz extracelular (fibronectina, tenascina C, COMP1, elastina, lumican e Cyr 61), lisil oxidase, PAI-1, trombospondina, caderina 11, TIMP-1, e múltiplas integrinas e caderina, bem como genes implicados na sinalização TGF-ß, IL-4 e IL-13.15
Expressão do gene foi medida numa biópsia de pele EMS em triplicado e em três biópsias de pele de controlo normal de sexo, idade e local anatómico independentes. Todas as amostras foram retiradas do antebraço esquerdo. Foram seleccionados 343 genes expressos diferentemente, utilizando Análise de Significância de Microarrays (FDR = 0,64%). Os genes seleccionados são indicados e os discutidos no texto estão em negrito. A figura completa com todos os nomes de genes está disponível como figura suplementar S3.
Para determinar se as vias TGF-β, IL-4 e IL-13, cada uma implicada na fibrose, foram reguladas de forma significativamente diferente na biopsia cutânea do SME, foi realizada uma Análise de Enriquecimento de Conjuntos Genéticos usando conjuntos de genes definidos experimentalmente.15 Todos os genes medidos foram classificados pela sua correlação com uma distinção idealizada entre o fenótipo saudável e o fenótipo EMS (Figs suplementares. S1A e S2A). Comparámos então as listas de genes classificados com as dos genes seleccionados aleatoriamente (Figs Suplementares S1B e S2B). Cada via recebeu uma pontuação de Enriquecimento (ES), que mede o significado estatístico da expressão diferencial. Para determinar se existe uma associação significativa com o fenótipo da doença, foi calculado um p-valor para o ES através da permutação das etiquetas da matriz e o ES foi recalculado (Figura Suplementar S1C e S2C). Para estimar o FDR, comparámos o ES da via experimentalmente determinada com o encontrado com subconjuntos de genes aleatoriamente seleccionados do mesmo tamanho (Figura Suplementar S1D e S2D). Isto avalia a probabilidade de encontrarmos um ES comparável ao verdadeiro ES se a via não estiver de facto relacionada com a doença. Tanto a via TGF-β (ES 0,3729) como a IL-4 (ES 0,2428) foram significativamente melhoradas com valores de p e FDRs <0,001. A via IL-13 (ES 0,2370) também foi aumentada, com um FDR baixo (0,0032), mas com um p-valor elevado (p-valor = 0,125). Isto sugere que, embora a via da IL-13 tenha apresentado provas de uma maior regulamentação, pode não ser responsável pela distinção entre pele EMS e pele de controlo saudável.
Embora o tratamento com prednisona e micofenolato tenha resultado numa melhoria modesta da força muscular proximal e da mialgia, juntamente com uma rápida resolução da eosinofilia do sangue periférico e das opacificações de vidro moído observadas nas tomografias computorizadas, a indução cutânea e a neuropatia progrediram. A repetição do NCS revelou amplitudes reduzidas ou ausentes de resposta sensorial e motora compatíveis com uma nova polineuropatia sensorimotora axonal dependente do comprimento, afectando as extremidades superiores e inferiores. A adição de metotrexato (20 mg semanalmente durante 5 meses) seguida de injecções diárias de anakinra durante 3 meses não produziu melhorias adicionais na mialgia, neuropatia, ou endurecimento cutâneo.