Nuevos conocimientos sobre los potenciales beneficios para la salud de las isoflavonas
Actividad antiinflamatoria y quimiopreventiva del isoflavonoide genisteína sola e incorporada en formulaciones farmacéuticas modernas
De las principales isoflavonas reportadas anteriormente, hemos estudiado la genisteína. Una de las líneas más importantes de nuestro grupo de investigación sobre este tema es el análisis del efecto quimiopreventivo del fitoestrógeno genisteína frente al melanoma maligno. El isoflavonoide genisteína (4′,5,7-trihidroxiisoflavona) es la aglicona del heterósido genistina. Es el compuesto más estudiado de la clase de las isoflavonas, junto con la daidzeína, la gliciteína, la formononetina, el equol y la biocanina A. Es el principal compuesto activo de las semillas de soja, Glycine max(L.) Merr, de la familia Fabaceae. En lo que respecta a las actividades biológicas, artículos recientes informan de que: la genisteína induce la apoptosis, inhibe la proliferación celular, modula la progresión del ciclo celular en diferentes líneas celulares cancerosas, inhibe la angiogénesis, suprime la activación y proliferación de los linfocitos, estabiliza los mastocitos y presenta leves propiedades antiinflamatorias . El fitoestrógeno también inhibe la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), que está directamente relacionada con la modificación del ADN y el daño tisular. Se ha postulado que la producción de ROS, especialmente por parte de las células activadas del sistema inmunitario, desempeña un papel importante en la carcinogénesis, en particular en la promoción de tumores.
En un estudio complejo reciente en el que se emplearon las líneas celulares de melanoma murino B164A5 y B16F10, hemos demostrado probando un amplio rango de concentraciones (150, 100, 50, 30, 15, 5 y 1 µM) que este fito-compuesto es un agente activo antiproliferativo y pro-apoptótico en estas dos líneas celulares. El ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) ha mostrado un IC50 de 41,1 µM de genisteína para las células B164A5 y 61,4 µM de genisteína para las células B16F10. El ensayo del éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) ha demostrado que, tras 24 horas de incubación, la proliferación de las células B16 disminuía cuando se trataban con 30 μM de genisteína. La genisteína a 100 µM fue capaz de causar la detención G2/M en el ciclo celular de estas líneas celulares de melanoma murino . Se realizó una tinción con DAPI para detectar los primeros signos de apoptosis. Cuando las células B16 se incubaron con 100 μM de genisteína, este fenómeno pudo detectarse y traducirse por una reducción del número de células y un aumento de la fragmentación nuclear en comparación con el grupo de control. Se realizó además un análisis de Western blot, para cuatro proteínas importantes implicadas en el proceso de apoptosis, a saber, la caspasa 3, la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), Bax y Bcl-2. La incubación con 100 μM de genisteína condujo para ambas líneas celulares B16 a la caspasa-3 escindida así como a la PARP escindida como responsables del mecanismo de los eventos apoptóticos. En otro estudio en el que se utilizaron todas las concentraciones probadas anteriormente (150, 100, 50, 30, 15, 5 y 1 µM de genisteína) y tras un periodo de incubación de 72 h, hemos demostrado que el fitoestrógeno no induce la activación de la caspasa-2 in vitro en las líneas celulares de melanoma B16. Para obtener una imagen completa de la apoptosis, es decir, para detectar las células apoptóticas tempranas y tardías, se realizó una tinción de annexina V-FITC/7AAD mediante citometría de fluorescencia en paralelo para las células de melanoma B16, así como para las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC). En su concentración más alta, la genisteína indujo un número ligeramente mayor de eventos apoptóticos en las células B16 que en las BMDC. El objetivo del estudio mencionado era encontrar un fármaco que «matara» las células cancerosas y estimulara la actividad inmunitaria. Para ello, se comprobó la posible actividad inmunoestimulante de la genisteína midiendo la citoquina antitumoral IL-12p70 liberada por los BMDC primarios murinos. El fitoestrógeno, a la concentración de 5 μM disminuyó el nivel de IL-12p70 de las DCs estimuladas por LPS. Estos resultados coinciden con la observación de que también se redujeron los niveles de ARNm de la IL-12p35. La actividad de las células T se examinó además analizando la concentración de las citocinas IFN-γ e IL-2 en el sobrenadante de las células del bazo de los ratones OT I que expresaban los receptores de células T transgénicos específicos de la ovoalbúmina. Los resultados han demostrado que la genisteína no tenía ningún efecto sobre la concentración de la citoquina IFN-γ e IL-2 .
Además de la actividad quimiopreventiva para el melanoma murino, nuestro grupo de investigación ha investigado la genisteína sola e incorporada en β-ciclodextrina metilada al azar (RAMEB), hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPBCD) e hidroxipropil-γ-ciclodextrina (HPGCD) en una proporción molar 1:1 para una serie de actividades biológicas. Se eligió este enfoque para aumentar la solubilidad en agua de este compuesto lipofílico. Los CDs son ciclo-oligosacáridos que presentan un lado exterior hidrofílico y un lado interior hidrofóbico con la capacidad de formar complejos de inclusión huésped-anfitrión con un mayor número de estructuras químicas . En primer lugar, se realizaron cálculos de química cuántica analizando el comportamiento en fase gaseosa, en agua y en dimetilsulfóxido, el disolvente utilizado para la solubilización de los agentes activos para todos los ensayos mencionados. Además, se comprobó que la incorporación de la genisteína en los CDs mencionados tuvo lugar mediante una serie de técnicas consagradas como los estudios de solubilidad en fase, la calorimetría diferencial de barrido (DSC), la difracción de rayos X y los ensayos de microscopía electrónica de barrido (SEM) . La genisteína y sus complejos de inclusión se estudiaron in vitro en cuatro tipos de líneas celulares de cáncer como HeLa (adenocarcinoma cervical), MCF-7 (adenocarcinoma de mama), A2780 (carcinoma de ovario humano) y A431 (carcinoma epidermoide de piel) utilizando las siguientes concentraciones: 1, 3, 10, 30, 60 y 90 μM y un periodo de incubación de 72 h. La línea celular de carcinoma de ovario humano A2780 demostró ser la más sensible a la genisteína, seguida de la HeLa. La proliferación no se vio afectada significativamente en las otras dos líneas celulares. Tras la incorporación en los CD mencionados, se produjeron cambios en la acción antiproliferativa con respecto a la línea celular probada. La línea celular de adenocarcinoma cervical HeLa fue más sensible para los tres complejos de inclusión en comparación con la genisteína pura. El mismo comportamiento se encontró para la línea celular A2780, excepto para el complejo con RAMEB. La complejación con RAMEB condujo a un aumento del IC50 también para las líneas celulares MCF-7 y A431. Para estas dos líneas celulares, la complejación de la genisteína con HPBCD parecía ser la mejor opción. En el mismo estudio, la genisteína y sus complejos con CD se analizaron mediante el método de difusión en disco de agar y el método de dilución contra varias cepas bacterianas: Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. Los compuestos probados a la concentración de 10 mM presentaron actividad antibacteriana sólo para B. subtilis. La última línea de este estudio se dirigió a las pruebas de efectos antiangiogénicos empleando la membrana corioalantoidea del embrión de pollo. La genisteína pura presentó efectos antiangiogénicos y el complejo HPBCD mostró una actividad superior. También para los otros dos complejos, a saber HPGCD y RAMEB pudo describirse un efecto antiangiogénico pero disminuido según se evaluó aplicando la puntuación 0-5.
Otro intento de aumentar la biodisponibilidad de este fitoestrógeno lipofílico se dirigió a la síntesis y análisis de un derivado de éster de genisteína con ácido mirístico y complejado con beta ciclodextrina. El éxito de la síntesis del nuevo compuesto, así como el éxito de su inclusión en la beta ciclodextrina, se determinó mediante ensayos consagrados como el análisis TLC, el análisis HPLC, la espectroscopia FTIR, la espectroscopia MS, la calorimetría diferencial de barrido (DSC) y la microscopia electrónica de barrido (SEM). Las muestras se probaron in vitro, utilizando el ensayo de proliferación MTT en tres líneas celulares humanas: HeLa-adenocarcinoma de cérvix, A2780-carcinoma de ovario y A431-carcinoma epidermoide de piel. Los resultados han demostrado que, tras un periodo de incubación de 72 h a las concentraciones de 10 y 30 µM, respectivamente, la genisteína es un agente activo sobre las líneas celulares HeLa (adenocarcinoma de cérvix) y A2780 (carcinoma de ovario). Las nuevas formulaciones no disminuyeron la viabilidad de las células cancerosas. Este comportamiento puede explicarse por el aumento de la estabilidad del complejo dentro del entorno in vitro.
Una nueva formulación moderna explorada por la industria farmacéutica, pero no la única, son las microestructuras de poliuretano (PM). ¿Qué nos determinó a centrarnos en estos compuestos? En función de la estructura de la partícula, este enfoque puede ofrecer: la posibilidad de modificar la lipo o la hidrosolubilidad de las estructuras de inclusión, la protección frente a agentes externos como la radiación UV o los entornos fuertemente ácidos o alcalinos, la entrega del fármaco hacia un receptor específico o el retraso de la actividad del compuesto biológicamente activo debido al uso de vehículos de transporte con baja velocidad de degradación . Basándonos en estas hipótesis, hemos sintetizado PM con un rendimiento de encapsulación del 68,3% de genisteína (p/p). La formulación se probó en vitrous el ensayo de proliferación MTT en tres líneas celulares de cáncer de mama humano MCF7, MDA-MB-231 y T47D-adenocarcinoma de mama humano. También se realizaron pruebas de actividad antimicrobiana y antifúngica contra las siguientes cepas S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella enteritidis, B. subtilis, Bacillus cereus y Candida albicans mediante el método de dilución. Los resultados nos hicieron concluir que los PM son un mal compañero in vitro para la genisteína.
También se realizaron ensayos in vivo para probar los efectos quimiopreventivos de la genisteína contra el melanoma murino. Durante la investigación en nuestro grupo, hemos observado en un modelo murino de melanoma, obtenido por inyección subcutánea de 0,1 ml de 1*105 células B164A5/ratón que, la genisteína después de un período de 15 días a una dosis de 15 mg/kg, el peso corporal disminuyó el volumen y el peso del tumor con aproximadamente un 30% y redujo los tumores de distancia. Las mediciones no invasivas utilizando el Sistema Adaptador Multisonda (MPA5) de Courage-Khazaka, Alemania, Mexameter® MX 18 mostraron que la genisteína redujo la cantidad de melanina y el grado de eritema directamente correlacionado con el número de días de tratamiento . Siendo muy conocida la relación entre la inflamación y el cáncer, hemos analizado el efecto de la genisteína en un modelo animal de inflamación de la oreja sola y tras su incorporación en hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPBCD) y en la beta-ciclodextrina aleatorizada (RAMEB). Las ciclodextrinas (CD) son agentes bien conocidos que se utilizan para aumentar la hidrosolubilidad de los agentes activos lipofílicos. El estudio concluyó que el fitoestrógeno, a una dosis de 2 mg, puede reconsiderarse como un compuesto natural antiinflamatorio activo en el modelo animal de inflamación C57BL/6 J. Además, se realizó la complejación de la genisteína con los CDs mencionados y se obtuvo un efecto antiinflamatorio más fuerte . En un estudio reciente, para intentar aumentar la biodisponibilidad de este fitoestrógeno, hemos adoptado una nueva estrategia que combina dos elementos: la formulación y la modalidad de administración. La formulación ha sido un cristal líquido lamelar liotrópico en el que se ha incorporado genisteína a una concentración del 3% y la formulación se ha aplicado localmente, con o sin electroporación (EP), utilizando el dispositivo Mezoforte Duo Mez 120905-D en C57BL6J. Los resultados han demostrado que los tumores aparecieron más tarde cuando se aplicó la electroporación. Durante los 21 días del experimento, la genisteína incorporada en la nueva formulación moderna, aplicada tópicamente de forma clásica, disminuyó el volumen del tumor, el grado de eritema y la cantidad de melanina de los ratones portadores de tumores de melanoma murino B16. Cuando la formulación se aplicó por electroporación, el pronóstico fue aún mejor. Sin embargo, el nuevo enfoque no tuvo ningún efecto en cuanto a las concentraciones séricas de la proteína S100B y de la enolasa específica de las neuronas (NSE), ni en la expresión tisular del anticuerpo contra el factor de crecimiento derivado de las plaquetas β (PDGFRβ). Asimismo, el extracto total de soja incorporado a la nueva formulación moderna de cristal líquido lamelar se probó in vitro en la línea celular de melanoma de ratón B164A5 para comprobar su potencial proapoptótico, empleando dos ensayos consagrados: tinción doble de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y anexina-FITC-7AAD. Se incubaron durante 72 horas 200 μg/ml de extracto de soja y 200 μg/ml de extracto de soja incorporados a la formulación líquida cristalina lamelar, junto con esta línea celular de melanoma murino. Los resultados han demostrado que el extracto de soja tiene propiedades pro-apoptóticas y que la incorporación en la nueva formulación no afecta de forma negativa a este efecto, siendo así un excipiente adecuado para los estudios in vivo. En un estudio reciente, se investigó la difusión y la penetración de la genisteína, respectivamente, de la genisteína incorporada en la formulación líquida cristalina lamelar liotrópica a través de diferentes membranas (una membrana sintética in vitro, la membrana corioalantoica del pollo (CAM) ex ovo y la epidermis humana ex vivo) mediante un tratamiento convencional sin PE, y también con la mediación del PE con la ayuda de un sistema de células de difusión Franz. Se aplicó la espectroscopia in vivoATR-FTIR y ex vivoRaman para analizar el efecto en la piel de los ratones . Los resultados han demostrado que la nueva formulación es un portador adecuado para la genisteína lipofílica. La formulación con el agente activo penetró en la piel, pero cuando se aplicó la electroporación, el transporte transdérmico del fármaco fue más rápido y eficaz. Esta observación fue validada por espectroscopia ATR-FTIR y Raman.
La investigación de nuestro grupo sobre el fitoestrógeno genisteína apunta hacia la clara conclusión de que este fitocompuesto es un agente quimiopreventivo activo contra el melanoma maligno tanto in vitro como in vivo. Se han realizado una serie de intentos para aumentar la biodisponibilidad de este compuesto lipofílico. No podemos decir que hayamos encontrado la formulación óptima, pero hemos conseguido mejorar los resultados en comparación con la sustancia pura. Se realizarán más estudios al respecto.