Nuove intuizioni sui potenziali benefici per la salute degli isoflavoni
Attività antinfiammatoria e chemiopreventiva dell’isoflavonoide genisteina da sola e incorporata in moderne formulazioni farmaceutiche
Dai principali isoflavoni riportati sopra, abbiamo studiato la genisteina. Una delle linee più importanti del nostro gruppo di ricerca su questo argomento riguarda l’analisi dell’effetto chemiopreventivo del fitoestrogeno genisteina contro il melanoma maligno. L’isoflavonoide genisteina (4′,5,7-triidrossiisoflavone) è l’aglicone dell’eteroside genistina. È il composto più studiato della classe degli isoflavoni insieme a daidzeina, gliciteina, formononetina, equolo e biocanina A. È il principale composto attivo dei semi di soia, Glycine max(L.) Merr. Per quanto riguarda le attività biologiche, recenti articoli riportano che: la genisteina induce l’apoptosi, inibisce la proliferazione cellulare, modula la progressione del ciclo cellulare su diverse linee cellulari cancerose, inibisce l’angiogenesi, sopprime l’attivazione e la proliferazione dei linfociti, stabilizza i mastociti e presenta leggere proprietà antinfiammatorie. Il fitoestrogeno inibisce anche la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) che è direttamente correlata alla modifica del DNA e al danno tissutale. La produzione di ROS, specialmente da parte delle cellule attivate del sistema immunitario, è stata postulata per svolgere un ruolo importante nella carcinogenesi, in particolare nella promozione del tumore.
In un recente studio complesso che utilizza le linee cellulari di melanoma murino B164A5 e B16F10, abbiamo dimostrato testando un’ampia gamma di concentrazioni (150, 100, 50, 30, 15, 5 e 1 µM) che questo fitocomposto è un agente antiproliferativo e pro-apoptotico attivo su queste due linee cellulari. Il test MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) ha mostrato un IC50 di 41,1 µM di genisteina per le cellule B164A5 e 61,4 µM di genisteina per le cellule B16F10. Il test CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) ha dimostrato che dopo 24 ore di incubazione, la proliferazione delle cellule B16 è diminuita se trattate con 30 μM di genisteina. La genisteina a 100 µM è stata in grado di causare l’arresto G2/M nel ciclo cellulare di queste linee cellulari di melanoma murino. La colorazione DAPI è stata eseguita per rilevare i primi segni di apoptosi. Quando le cellule B16 sono state incubate con 100 μM di genisteina, questo fenomeno ha potuto essere rilevato e tradotto con una riduzione del numero di cellule e un aumento della frammentazione nucleare rispetto al gruppo di controllo. L’analisi Western blot è stata ulteriormente condotta, per quattro importanti proteine coinvolte nel processo di apoptosi, cioè caspasi 3, polimerasi (ADP-ribosio) (PARP), Bax e Bcl-2. L’incubazione con 100 μM di genisteina ha indotto per entrambe le linee cellulari B16 la caspasi-3 scissa e la PARP scissa come responsabili del meccanismo degli eventi apoptotici. In un altro studio utilizzando tutte le concentrazioni precedentemente testate (150, 100, 50, 30, 15, 5 e 1 µM di genisteina) e dopo un periodo di incubazione di 72 h, abbiamo dimostrato che il fitoestrogeno non induce l’attivazione della caspasi-2 in vitro sulle linee cellulari di melanoma B16. Al fine di ottenere il quadro completo dell’apoptosi, vale a dire per rilevare le cellule apoptotiche precoci e tardive, la colorazione con annexina V-FITC/7AAD è stata eseguita in parallelo mediante citometria a fluorescenza per le cellule di melanoma B16 e per le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC). Alla sua massima concentrazione, la genisteina ha indotto un numero leggermente maggiore di eventi apoptotici nelle cellule B16 che nelle BMDC. Lo scopo dello studio sopra menzionato era quello di trovare un farmaco che “uccida” le cellule cancerose e stimoli l’attività immunitaria. A questo scopo, la potenziale attività immunostimolante della genisteina è stata testata misurando la citochina antitumorale IL-12p70 rilasciata dalle BMDC primarie murine. Il fitoestrogeno, alla concentrazione di 5 μM ha diminuito il livello di IL-12p70 delle DCs stimolate da LPS. Questi risultati erano in linea con l’osservazione che anche i livelli di mRNA IL-12p35 sono stati downregolati. L’attività delle cellule T è stata ulteriormente vagliata analizzando la concentrazione delle citochine IFN-γ e IL-2 nel surnatante delle cellule della milza dei topi OT I che esprimono i recettori transgenici specifici per l’ovalbumina. I risultati hanno dimostrato che la genisteina non ha avuto alcun effetto sulla concentrazione di IFN-γ e IL-2 citochina.
Oltre all’attività chemiopreventiva per il melanoma murino, il nostro gruppo di ricerca ha studiato la genisteina da sola e incorporata in β-ciclodestrine metilate a caso (RAMEB), idrossipropil-β-ciclodestrine (HPBCD) e idrossipropil-γ-ciclodestrine (HPGCD) in un rapporto molare 1:1 per una serie di attività biologiche. Questo approccio è stato scelto per aumentare la solubilità in acqua di questo composto lipofilo. I CD sono ciclo-oligosaccaridi che presentano un lato esterno idrofilo e un lato interno idrofobo con la capacità di formare complessi di inclusione ospite-ospite con un numero maggiore di strutture chimiche. In primo luogo, sono stati eseguiti calcoli di chimica quantistica analizzando il comportamento in fase gassosa, in acqua e in dimetilsulfossido, il solvente utilizzato per la solubilizzazione degli agenti attivi per tutti i saggi menzionati. Inoltre, è stato dimostrato che l’incorporazione della genisteina nei CD summenzionati è avvenuta tramite una serie di tecniche consacrate come studi di solubilità di fase, calorimetria differenziale a scansione (DSC), diffrazione a raggi X e saggi di microscopia elettronica a scansione (SEM). La genisteina e i suoi complessi di inclusione sono stati studiati in vitro su quattro tipi di linee cellulari tumorali come HeLa (adenocarcinoma cervicale), MCF-7 (adenocarcinoma mammario), A2780 (carcinoma ovarico umano) e A431 (carcinoma epidermoide della pelle) utilizzando le seguenti concentrazioni: 1, 3, 10, 30, 60 e 90 μM e un periodo di incubazione di 72 ore. La linea cellulare di carcinoma ovarico umano A2780 si è dimostrata la più sensibile alla genisteina, seguita dalla HeLa. La proliferazione non è stata significativamente influenzata dalle altre due linee cellulari. Dopo l’incorporazione nei suddetti CD, si sono verificati cambiamenti nell’azione antiproliferativa rispetto alla linea cellulare testata. La linea cellulare di adenocarcinoma cervicale HeLa è stata più sensibile per tutti e tre i complessi di inclusione rispetto alla genisteina pura. Lo stesso comportamento è stato trovato per la linea cellulare A2780, ad eccezione del complesso con RAMEB. La complessazione con RAMEB ha portato ad un aumento dell’IC50 anche per le linee cellulari MCF-7 e A431. Per queste due linee cellulari, la complessazione della genisteina con HPBCD sembrava essere l’opzione migliore. Nello stesso studio, la genisteina e i suoi complessi CD sono stati analizzati con il metodo della diffusione su disco di agar e il metodo della diluizione contro diversi ceppi batterici: Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. I composti testati alla concentrazione di 10 mM hanno presentato attività antibatterica solo per B. subtilis. L’ultima linea di questo studio è stata tracciata verso i test per gli effetti antiangiogenici utilizzando la membrana corioallantoica dell’embrione di pollo. La genisteina pura ha presentato effetti antiangiogenici e il complesso HPBCD ha mostrato un’attività superiore. Anche per gli altri due complessi, vale a dire HPGCD e RAMEB potrebbe essere descritto un effetto antiangiogenico ma un effetto diminuito come valutato applicando il punteggio 0-5.
Un altro tentativo di aumentare la biodisponibilità di questo fitoestrogeno lipofilo è stato diretto verso la sintesi e l’analisi di un derivato estere della genisteina con acido miristico e complessato con beta ciclodestrina. Il successo della sintesi del nuovo composto, così come il successo dell’inclusione nella beta ciclodestrina, è stato determinato utilizzando saggi consacrati come l’analisi TLC, l’analisi HPLC, la spettroscopia FTIR, la spettroscopia MS, la calorimetria differenziale a scansione (DSC) e la microscopia elettronica a scansione (SEM). I campioni sono stati testati in vitro, utilizzando il test di proliferazione MTT su tre linee cellulari umane: Adenocarcinoma della cervice HeLa, carcinoma ovarico A2780 e carcinoma epidermoide della pelle A431. I risultati hanno dimostrato che, dopo un periodo di incubazione di 72 ore alle concentrazioni di 10 e 30 µM, rispettivamente, la genisteina è un agente attivo sulle linee cellulari HeLa (adenocarcinoma della cervice) e A2780 (carcinoma ovarico). Le nuove formulazioni non hanno diminuito la vitalità delle cellule cancerose. Questo comportamento può essere spiegato dalla maggiore stabilità del complesso nell’ambiente in vitro.
Una nuova formulazione moderna esplorata dall’industria farmaceutica, ma non solo, sono le microstrutture di poliuretano (PM). Cosa ci ha spinto a concentrarci su questi composti? A seconda della struttura della particella, tale approccio può offrire: la possibilità di modificare la lipo- o idrosolubilità delle strutture di inclusione, la protezione da agenti esterni come le radiazioni UV, forti ambienti acidi o alcalini, la consegna del farmaco verso un recettore specifico o ritardare l’attività del composto biologicamente attivo grazie all’uso di veicoli di trasporto a bassa velocità di degradazione. Sulla base di queste ipotesi, abbiamo sintetizzato PM con una resa di incapsulamento del 68,3% di genisteina (w/w). La formulazione è stata testata in vitro con il test di proliferazione MTT su tre linee cellulari di cancro al seno umano MCF7, MDA-MB-231 e T47D-human breast adenocarcinoma. Sono stati eseguiti anche test per l’attività antimicrobica e antifungina contro i seguenti ceppi: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella enteritidis, B. subtilis, Bacillus cereus e Candida albicansutilizzando il metodo della diluizione. I risultati ci hanno fatto concludere che le PM sono un cattivo partner di trasporto in vitro per la genisteina.
Sono stati eseguiti anche test in vivo per verificare gli effetti chemiopreventivi della genisteina contro il melanoma murino. Durante la ricerca nel nostro gruppo, abbiamo osservato in un modello murino di melanoma, ottenuto mediante iniezione sottocutanea di 0,1 ml di 1*105 cellule B164A5/mouse che, la genisteina dopo un periodo di 15 giorni alla dose di 15 mg/kg, peso corporeo ha diminuito il volume e il peso del tumore con circa il 30% e ridotto i tumori a distanza. Misurazioni non invasive utilizzando il Multiprobe Adapter System (MPA5) di Courage-Khazaka, Germania, Mexameter® MX 18 hanno dimostrato che la genisteina ha ridotto la quantità di melanina e il grado di eritema direttamente correlato al numero di giorni di trattamento. Essendo molto noto il legame tra infiammazione e cancro, abbiamo analizzato l’effetto della genisteina in un modello animale di infiammazione dell’orecchio da sola e dopo l’incorporazione in idrossipropil-beta-ciclodestrina (HPBCD) e in random-methylated-beta-ciclodestrina (RAMEB). Le ciclodestrine (CD) sono agenti ben noti utilizzati per aumentare l’idrosolubilità degli agenti attivi lipofili. Lo studio ha concluso che il fitoestrogeno, alla dose di 2 mg può essere riconsiderato come un composto naturale attivo anti-infiammatorio sul modello animale di infiammazione C57BL/6 J. Inoltre, la complessazione della genisteina con i suddetti CD è stata fatta e ha portato ad un effetto antinfiammatorio più forte. In uno studio recente, per cercare di aumentare la biodisponibilità di questo fitoestrogeno, abbiamo adottato una nuova strategia che combina due elementi: la formulazione e la modalità di somministrazione. La formulazione era a cristalli liquidi liotropici lamellari in cui la genisteina è stata incorporata alla concentrazione 3% e la formulazione è stata applicata localmente, con o senza elettroporazione (EP), utilizzando il dispositivo Mezoforte Duo Mez 120905-D su C57BL6J. I risultati hanno dimostrato che i tumori sono apparsi più tardi quando è stata applicata l’elettroporazione. Durante i 21 giorni dell’esperimento, la genisteina incorporata nella nuova formulazione moderna, applicata topicamente classica ha diminuito il volume tumorale, il grado di eritema e la quantità di melanina per i topi portatori di tumori di melanoma murino B16. Quando la formulazione è stata applicata per elettroporazione, la prognosi è stata ancora migliore. Tuttavia, il nuovo approccio non ha avuto alcun effetto in termini di concentrazioni sieriche della proteina S100B e dell’enolasi neurone-specifica (NSE), o l’espressione tissutale dell’anticorpo PDGFRβ (platelet-derived growth factor receptor β). Inoltre, l’estratto totale di soia incorporato nella nuova formulazione lamellare moderna a cristalli liquidi è stato testato in vitro sulla linea cellulare di melanoma di topo B164A5 per il suo potenziale pro-apoptotico, utilizzando due saggi consacrati: 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e doppia colorazione annexina-FITC-7AAD. 200 μg/ml di estratto di soia, rispettivamente 200 μg/ml di estratto di soia incorporato nella formulazione lamellare liotropica a cristalli liquidi sono stati incubati per 72 ore insieme a questa linea cellulare di melanoma murino. I risultati hanno dimostrato che l’estratto di soia ha proprietà pro-apoptotiche e l’incorporazione nella nuova formulazione non influisce negativamente su questo effetto essendo così un eccipiente adatto per gli studi in vivo. In uno studio recente, la diffusione e la penetrazione di genisteina, rispettivamente, genisteina incorporata nella formulazione cristallina liquida liotropica lamellare attraverso diverse membrane (una membrana sintetica in vitro, membrana corioallantoica di pulcino (CAM) ex ovo, ed epidermide umana escissa ex vivo) sono state studiate anche con un trattamento convenzionale senza EP, e anche con la mediazione di EP con l’aiuto di un sistema cellulare di diffusione Franz. La spettroscopia in vivoATR-FTIR ed ex vivoRaman sono state applicate per analizzare l’effetto sulla pelle dei topi. I risultati hanno dimostrato che la nuova formulazione è un vettore adatto per la genisteina lipofila. La formulazione con l’agente attivo è penetrata nella pelle, ma quando è stata applicata l’elettroporazione, il trasporto transdermico del farmaco è stato più rapido ed efficace. Questa osservazione è stata convalidata dalla spettroscopia ATR-FTIR e Raman.
La ricerca del nostro gruppo sul fitoestrogeno genisteina punta verso la chiara conclusione che questo fitocomposto è un agente chemiopreventivo attivo contro il melanoma maligno sia in vitro che in vivo. Sono stati fatti una serie di tentativi per aumentare la biodisponibilità di questo composto lipofilo. Non possiamo dire di aver trovato la formulazione ottimale, ma siamo riusciti a migliorare i risultati rispetto alla sostanza pura. Ulteriori studi saranno condotti su questo argomento.