New Insights Regarding the Potential Health Benefits of Isoflavones
Anty-zapalna i chemoprewencyjna aktywność izoflawonoidu genisteiny samej i włączonej do nowoczesnych preparatów farmaceutycznych
Z głównych izoflawonów opisanych powyżej, badaliśmy genisteinę. Jedną z najważniejszych linii w naszej grupie badawczej w tym temacie jest analiza chemoprewencyjnego działania fitoestrogenu genisteiny przeciwko czerniakowi złośliwemu. Izoflawonoid genisteina (4′,5,7-trihydroksyizoflawon) jest aglikonem heterozydu genistyny. Jest to najczęściej badany związek z klasy izoflawonów wraz z daidzeiną, glicytyną, formononetyną, equolem i biochaniną A. Jest to główny aktywny związek z nasion soi (Glycine max(L.) Merr., rodzina Fabaceae). Jeśli chodzi o aktywność biologiczną, ostatnie prace donoszą, że: genisteina indukuje apoptozę, hamuje proliferację komórek, moduluje progresję cyklu komórkowego na różnych nowotworowych liniach komórkowych, hamuje angiogenezę, hamuje aktywację i proliferację limfocytów, stabilizuje komórki tuczne i wykazuje łagodne właściwości przeciwzapalne. Fitoestrogen hamuje również produkcję reaktywnych form tlenu (ROS), która jest bezpośrednio skorelowana z modyfikacją DNA i uszkodzeniem tkanek. Produkcja ROS, zwłaszcza przez aktywowane komórki układu odpornościowego, postuluje się odgrywać ważną rolę w kancerogenezie, zwłaszcza w promocji nowotworu .
W niedawnym kompleksowym badaniu zatrudniających, B164A5 i B16F10 linii komórkowych czerniaka myszy, wykazaliśmy testowanie szerokiego zakresu stężeń (150, 100, 50, 30, 15, 5 i 1 µM), że ten fitokomponent jest aktywnym antyproliferacyjne i pro-apoptotyczne agent na tych dwóch linii komórkowych. Test MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy) wykazał IC50 na poziomie 41,1 µM genisteiny dla komórek B164A5 i 61,4 µM genisteiny dla komórek B16F10. Test z estrem sukcynimidylowym karboksyfluoresceiny diacetyny (CFSE) wykazał, że po 24 h inkubacji proliferacja komórek B16 była zmniejszona po podaniu 30 μM genisteiny. Genisteina w stężeniu 100 µM była w stanie spowodować zatrzymanie G2/M w cyklu komórkowym tych linii komórkowych czerniaka mysiego. Barwienie DAPI zostało wykonane w celu wykrycia pierwszych oznak apoptozy. Kiedy komórki B16 były inkubowane z 100 μM genisteiny, zjawisko to można było wykryć i tłumaczyć poprzez zmniejszenie liczby komórek i wzrost fragmentacji jądra w porównaniu z grupą kontrolną. Następnie przeprowadzono analizę Western blot dla czterech ważnych białek biorących udział w procesie apoptozy, a mianowicie kaspazy 3, polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP), Bax i Bcl-2. Inkubacja z 100 μM genisteiny prowadziła w przypadku obu linii komórkowych B16 do rozszczepienia kaspazy-3, jak również rozszczepienia PARP jako odpowiedzialnych za mechanizm zdarzeń apoptotycznych. W innym badaniu z użyciem wszystkich poprzednio testowanych stężeń (150, 100, 50, 30, 15, 5 i 1 μM genisteiny) i po okresie inkubacji 72 h, wykazaliśmy, że fitoestrogen nie indukuje aktywacji kaspazy-2 w liniach komórkowych czerniaka B16 in vitro. W celu uzyskania pełnego obrazu apoptozy, a mianowicie w celu wykrycia wczesnych i późnych komórek apoptotycznych, barwienie aneksyną V-FITC/7AAD zostało wykonane metodą cytometrii fluorescencyjnej równolegle dla komórek czerniaka B16, jak również dla komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDCs). W najwyższym stężeniu genisteina indukowała nieco więcej zdarzeń apoptotycznych w komórkach B16 niż w BMDCs. Celem powyższych badań było znalezienie leku, który „zabijając” komórki nowotworowe, stymulowałby jednocześnie aktywność immunologiczną. W tym celu sprawdzono potencjalną aktywność immunostymulacyjną genisteiny poprzez pomiar antytumorgennej cytokiny IL-12p70 uwalnianej przez mysie BMDCs. Fitoestrogen w stężeniu 5 μM zmniejszał poziom IL-12p70 w DCs stymulowanych LPS. Wyniki te były zgodne z obserwacją, że również poziom mRNA IL-12p35 uległ obniżeniu. Aktywność komórek T badano analizując stężenie cytokin IFN-γ i IL-2 w supernatancie komórek śledziony myszy OT I z ekspresją specyficznych dla owalbuminy transgenicznych receptorów komórek T. Wyniki wykazały, że genisteina nie miała wpływu na stężenie cytokin IFN-γ i IL-2.
Poza aktywnością chemoprewencyjną dla czerniaka myszy, nasza grupa badawcza zbadała genisteinę samą i włączoną do losowo metylowanej β-cyklodekstryny (RAMEB), hydroksypropyl-β-cyklodekstryny (HPBCD) i hydroksypropyl-γ-cyklodekstryny (HPGCD) w stosunku molowym 1:1 dla szeregu aktywności biologicznych. Takie podejście zostało wybrane w celu zwiększenia rozpuszczalności w wodzie tego lipofilowego związku. CD są cyklo-oligosacharydami o hydrofilowej stronie zewnętrznej i hydrofobowej stronie wewnętrznej, posiadającymi zdolność do tworzenia kompleksów inkluzyjnych gospodarz-gość o zwiększonej liczbie struktur chemicznych. Po pierwsze, przeprowadzono obliczenia kwantowo-chemiczne analizujące zachowanie w fazie gazowej, w wodzie i w sulfotlenku dimetylu, rozpuszczalniku używanym do solubilizacji substancji aktywnych we wszystkich wymienionych testach. Dodatkowo, udowodniono, że inkorporacja genisteiny do wyżej wymienionych CD miała miejsce poprzez serię konsekrowanych technik, takich jak badania rozpuszczalności fazowej, różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC), dyfrakcja rentgenowska i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM). Genisteina i jej kompleksy inkluzyjne były badane in vitro na czterech typach nowotworowych linii komórkowych, takich jak HeLa (gruczolakorak szyjki macicy), MCF-7 (gruczolakorak piersi), A2780 (ludzki rak jajnika) i A431 (rak nabłonkowy skóry) przy użyciu następujących stężeń: 1, 3, 10, 30, 60 i 90 μM i okresie inkubacji 72 h. Linia komórkowa A2780 human ovarian carcinoma okazała się najbardziej wrażliwa na genisteinę, a następnie HeLa. W przypadku pozostałych dwóch linii komórkowych proliferacja nie uległa znacznemu pogorszeniu. Po włączeniu do wyżej wymienionych płyt CD nastąpiły zmiany w działaniu antyproliferacyjnym w odniesieniu do badanej linii komórkowej. Linia komórkowa gruczolakoraka szyjki macicy HeLa była bardziej wrażliwa na wszystkie trzy kompleksy inkluzyjne w porównaniu z czystą genisteiną. Takie samo zachowanie zaobserwowano dla linii komórkowej A2780, z wyjątkiem kompleksu z RAMEB. Kompleksowanie z RAMEB prowadziło do zwiększenia IC50 również w przypadku linii komórkowych MCF-7 i A431. Dla tych dwóch linii komórkowych kompleksowanie genisteiny z HPBCD wydawało się być najlepszą opcją. W tym samym badaniu, genisteina i jej kompleksy z CD były analizowane metodą dyfuzyjno-krążkową oraz metodą rozcieńczeniową wobec kilku szczepów bakteryjnych: Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosaand Staphylococcus aureus. Badane związki w stężeniu 10 mM wykazywały aktywność przeciwbakteryjną tylko dla B. subtilis. Ostatnim kierunkiem badań były testy na działanie antyangiogenne z wykorzystaniem błony kosmówkowej zarodka kurzego. Czysta genisteina wykazała działanie antyangiogenne, a kompleks z HPBCD wykazał wyższą aktywność. Również w przypadku dwóch pozostałych kompleksów, tj. HPGCD i RAMEB, można było mówić o działaniu antyangiogennym, ale zmniejszonym, ocenianym w skali 0-5.
Kolejna próba zwiększenia biodostępności tego lipofilnego fitoestrogenu została ukierunkowana na syntezę i analizę pochodnej estru genisteiny z kwasem mirystynowym, skompleksowanej beta-cyklodekstryną. Pomyślną syntezę nowego związku, jak również pomyślne włączenie do beta-cyklodekstryny, określono przy użyciu konsekrowanych testów, takich jak analiza TLC, analiza HPLC, spektroskopia FTIR, spektroskopia MS, skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC) i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM). Próbki badano in vitro, stosując test proliferacji MTT na trzech ludzkich liniach komórkowych: HeLa- gruczolakorak szyjki macicy, A2780- rak jajnika oraz A431- rak nabłonkowy skóry. Wyniki wykazały, że po okresie inkubacji 72 h w stężeniach odpowiednio 10 i 30 µM genisteina jest aktywnym czynnikiem na liniach komórkowych HeLa (gruczolakorak szyjki macicy) i A2780 (rak jajnika). Nowe preparaty nie obniżyły żywotności komórek nowotworowych. Takie zachowanie można tłumaczyć zwiększoną stabilnością kompleksu w środowisku in vitro .
Nową nowoczesną formulacją eksplorowaną przez przemysł farmaceutyczny, ale nie tylko, są mikrostruktury poliuretanowe (PM). Co zdecydowało, że skupiliśmy się właśnie na tych związkach? W zależności od struktury cząsteczki, takie podejście może oferować: możliwość zmiany lipo- lub wodorozpuszczalności struktur inkluzyjnych, ochronę przed czynnikami zewnętrznymi, takimi jak promieniowanie UV, silnie kwaśne lub zasadowe środowisko, dostarczanie leku w kierunku określonego receptora lub opóźnienie aktywności związku biologicznie czynnego dzięki zastosowaniu środków transportu o niskiej prędkości degradacji. W oparciu o te hipotezy zsyntetyzowano PM z wydajnością enkapsulacji 68,3% genisteiny (w/w). Preparat został przebadany w teście proliferacji MTT na trzech ludzkich liniach komórkowych raka piersi: MCF7, MDA-MB-231 i T47D. Przeprowadzono również badania aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybiczej wobec następujących szczepów: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella enteritidis, B. subtilis, Bacillus cereus i Candida albicansemploying the dilution method. Uzyskane wyniki pozwoliły na stwierdzenie, że PM są złym nośnikiem genisteiny w warunkach in vitro.
W badaniach in vivo sprawdzono również działanie chemoprewencyjne genisteiny wobec czerniaka myszy. Podczas badań w naszej grupie zaobserwowaliśmy w modelu czerniaka u myszy, uzyskanym poprzez podskórne wstrzyknięcie 0,1 ml 1*105 komórek B164A5/mysz, że genisteina po okresie 15 dni w dawce 15 mg/kg masy ciała zmniejszyła objętość i masę guza o około 30% oraz zredukowała guzy dystansowe. Nieinwazyjne pomiary przy użyciu Multiprobe Adapter System (MPA5) firmy Courage-Khazaka, Niemcy, Mexameter® MX 18 wykazały, że genisteina zmniejszyła ilość melaniny i stopień rumienia bezpośrednio skorelowany z liczbą dni leczenia. Ponieważ związek między stanem zapalnym a rakiem jest bardzo dobrze znany, przeanalizowaliśmy działanie genisteiny w zwierzęcym modelu zapalenia ucha, samej i po włączeniu do hydroksypropylobeta-cyklodekstryny (HPBCD) i losowo-metylowanej-beta-cyklodekstryny (RAMEB). Cyklodekstryny (CD) są dobrze znanymi środkami stosowanymi do zwiększenia hydro-rozpuszczalności aktywnych środków lipofilowych. W badaniach stwierdzono, że fitoestrogen w dawce 2 mg może być ponownie rozważany jako aktywny przeciwzapalny związek naturalny na zwierzęcym modelu zapalenia C57BL/6 J. Dodatkowo wykonano kompleksowanie genisteiny z wyżej wymienionymi CD, co doprowadziło do silniejszego efektu przeciwzapalnego. W ostatnich badaniach, w celu podjęcia próby zwiększenia biodostępności tego fitoestrogenu, przyjęliśmy nową strategię, która łączy dwa elementy: formulację i sposób podawania. Formuła była lamelarnym liotropowym ciekłym kryształem, w którym genisteina była włączona w stężeniu 3% i formuła była stosowana miejscowo, z lub bez elektroporacji (EP), przy użyciu urządzenia Mezoforte Duo Mez 120905-D na C57BL6J. Wyniki wykazały, że guzy pojawiły się później, gdy zastosowano elektroporację. W ciągu 21 dni eksperymentu genisteina zawarta w nowej, nowoczesnej formulacji, zastosowana miejscowo klasycznie zmniejszyła objętość guza, stopień rumienia i ilość melaniny u myszy z guzami czerniaka B16. Gdy preparat zastosowano metodą elektroporacji, rokowanie było jeszcze lepsze. Nowe podejście nie miało jednak wpływu na stężenie w surowicy białka S100B i enolazy specyficznej dla neuronów (NSE), ani na ekspresję tkankową przeciwciała przeciwko receptorowi β płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGFRβ). Ponadto, całkowity ekstrakt sojowy włączony do nowej nowoczesnej formulacji lamelarnej liotropowej ciekłokrystalicznej był badany in vitro na linii komórkowej mysiego czerniaka B164A5 pod kątem jego potencjału pro-apoptotycznego, przy użyciu dwóch uznanych testów: 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i podwójnego barwienia aneksyn-FITC-7AAD. 200 μg/ml ekstraktu sojowego, odpowiednio 200 μg/ml ekstraktu sojowego włączonego do lamelarnej, liotropowej, ciekłokrystalicznej formulacji inkubowano przez 72 h razem z linią komórkową czerniaka mysiego. Wyniki wykazały, że ekstrakt sojowy ma właściwości pro-apoptotyczne, a włączenie go do nowej formulacji nie wpływa negatywnie na ten efekt, dzięki czemu jest on odpowiednią substancją pomocniczą w badaniach in vivostudies. W ostatnim badaniu dyfuzja i penetracja genisteiny, odpowiednio, genisteiny włączonej do lamelarnej, liotropowej ciekłokrystalicznej postaci preparatu przez różne błony (błona syntetyczna in vitro, błona chorioallantoiczna kurcząt (CAM) ex ovo i wycięty ludzki naskórek ex vivo) były również badane poprzez konwencjonalne traktowanie bez EP, a także z pośrednictwem EP za pomocą systemu komórek dyfuzyjnych Franza. Zastosowano spektroskopię in vivoATR-FTIR i ex vivoRaman w celu przeanalizowania wpływu na skórę myszy. Wyniki badań wykazały, że nowa formulacja jest odpowiednim nośnikiem dla lipofilnej genisteiny. Formuła z substancją aktywną przenikała przez skórę, ale gdy zastosowano elektroporację, transdermalny transport leku był szybszy i bardziej efektywny. Obserwacja ta została potwierdzona zarówno przez spektroskopię ATR-FTIR jak i Ramana.
Badania naszej grupy nad fitoestrogenem genisteiną wskazują na jednoznaczny wniosek, że ten fitozwiązek jest aktywnym środkiem chemoprewencyjnym przeciwko czerniakowi złośliwemu zarówno in vitro jak i in vivo. Podjęto szereg prób mających na celu zwiększenie biodostępności tego lipofilnego związku. Nie można powiedzieć, że udało się znaleźć optymalną formulację, ale udało się poprawić wyniki w porównaniu z czystą substancją. Będą prowadzone dalsze badania w tym zakresie.