Nouvelles perspectives concernant les avantages potentiels des isoflavones pour la santé
Activité anti-inflammatoire et chimiopréventive de l’isoflavonoïde génistéine seul et incorporé dans des formulations pharmaceutiques modernes
Parmi les principales isoflavones signalées ci-dessus, nous avons étudié la génistéine. L’un des axes les plus importants de notre groupe de recherche sur ce sujet concerne l’analyse de l’effet chimiopréventif du phyto-œstrogène génistéine contre le mélanome malin. L’isoflavonoïde génistéine (4′,5,7-trihydroxyisoflavone) est l’aglycone de l’hétéroside génistine. C’est le composé le plus étudié de la classe des isoflavones avec la daidzéine, la glycitéine, la formononétine, l’équol et la biochanine A. C’est le principal composé actif des graines de soja, Glycine max(L.) Merr. de la famille des Fabaceae. En ce qui concerne les activités biologiques, des articles récents rapportent que : la génistéine induit l’apoptose, inhibe la prolifération cellulaire, module la progression du cycle cellulaire sur différentes lignées cellulaires cancéreuses, inhibe l’angiogenèse, supprime l’activation et la prolifération des lymphocytes, stabilise les mastocytes et présente de légères propriétés anti-inflammatoires. Le phytoestrogène inhibe également la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui est directement corrélée à la modification de l’ADN et aux dommages tissulaires. La production de ROS, en particulier par les cellules activées du système immunitaire, a été postulée pour jouer un rôle important dans la carcinogenèse, notamment dans la promotion des tumeurs .
Dans une étude complexe récente employant, les lignées cellulaires de mélanome murin B164A5 et B16F10, nous avons montré en testant une large gamme de concentrations (150, 100, 50, 30, 15, 5 et 1 µM) que ce phytocomposé est un agent antiprolifératif et pro-apoptotique actif sur ces deux lignées cellulaires. Le test MTT (bromure de 3-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) a montré une CI50 de 41,1 µM de génistéine pour les cellules B164A5 et de 61,4 µM de génistéine pour les cellules B16F10. Le test de l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine diacétate (CFSE) a montré qu’après 24 h d’incubation, la prolifération des cellules B16 était diminuée lorsqu’elles étaient traitées avec 30 μM de génistéine. La génistéine à 100 µM était capable de provoquer un arrêt G2/M dans le cycle cellulaire de ces lignées cellulaires de mélanome murin . Une coloration au DAPI a été effectuée afin de détecter les premiers signes d’apoptose. Lorsque les cellules B16 ont été incubées avec 100 μM de génistéine, ce phénomène a pu être détecté et traduit par une réduction du nombre de cellules et une augmentation de la fragmentation nucléaire par rapport au groupe témoin . Une analyse Western blot a également été réalisée pour quatre protéines importantes impliquées dans le processus d’apoptose, à savoir la caspase 3, la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP), Bax et Bcl-2. L’incubation avec 100 μM de génistéine a conduit pour les deux lignées cellulaires B16 à la caspase-3 clivée ainsi qu’à la PARP clivée comme responsables du mécanisme des événements apoptotiques. Dans une autre étude utilisant toutes les concentrations précédemment testées (150, 100, 50, 30, 15, 5 et 1 µM de génistéine) et après une période d’incubation de 72 h, nous avons montré que le phytoestrogène n’induit pas l’activation de la caspase-2 in vitro sur les lignées cellulaires de mélanome B16. Afin d’obtenir une image complète de l’apoptose, c’est-à-dire de détecter les cellules apoptotiques précoces et tardives, une coloration à l’annexine V-FITC/7AAD a été réalisée par cytométrie de fluorescence en parallèle pour les cellules de mélanome B16 ainsi que pour les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC). À sa concentration la plus élevée, la génistéine a induit un peu plus d’événements apoptotiques dans les cellules B16 que dans les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse. L’objectif de l’étude susmentionnée était de trouver un médicament qui « tue » les cellules cancéreuses et stimule l’activité immunitaire. Dans ce but, l’activité potentielle de stimulation immunitaire de la génistéine a été testée en mesurant la cytokine anti-tumorigène IL-12p70 libérée par les BMDCs primaires murins. Le phytoestrogène, à la concentration de 5 μM, a diminué le niveau d’IL-12p70 des DCs stimulées par le LPS. Ces résultats étaient en accord avec l’observation que les niveaux d’ARNm de l’IL-12p35 étaient également régulés à la baisse. L’activité des cellules T a été examinée plus en détail en analysant la concentration des cytokines IFN-γ et IL-2 dans le surnageant des cellules de la rate de souris OT I exprimant les récepteurs transgéniques de cellules T spécifiques de l’ovalbumine. Les résultats ont montré que la génistéine n’avait aucun effet sur la concentration de la cytokine IFN-γ et IL-2 .
En dehors de l’activité chimiopréventive pour le mélanome murin, notre groupe de recherche a étudié la génistéine seule et incorporée dans la β-cyclodextrine méthylée au hasard (RAMEB), l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HPBCD) et l’hydroxypropyl-γ-cyclodextrine (HPGCD) dans un rapport molaire 1:1 pour une gamme d’activités biologiques. Cette approche a été choisie afin d’augmenter la solubilité dans l’eau de ce composé lipophile. Les CD sont des cyclo-oligosaccharides présentant une face extérieure hydrophile et une face intérieure hydrophobe, capables de former des complexes d’inclusion hôte-invité avec un nombre accru de structures chimiques. Tout d’abord, des calculs de chimie quantique ont été effectués pour analyser le comportement en phase gazeuse, dans l’eau et dans le diméthylsulfoxyde, le solvant utilisé pour la solubilisation des agents actifs pour tous les essais mentionnés. En outre, il a été prouvé que l’incorporation de la génistéine dans les CD susmentionnés a eu lieu par une série de techniques consacrées telles que les études de solubilité de phase, la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), la diffraction des rayons X et les essais de microscopie électronique à balayage (SEM). La génistéine et ses complexes d’inclusion ont été étudiés in vitro sur quatre types de lignées cellulaires cancéreuses telles que HeLa (adénocarcinome cervical), MCF-7 (adénocarcinome mammaire), A2780 (carcinome ovarien humain) et A431 (carcinome épidermoïde cutané) en utilisant les concentrations suivantes : 1, 3, 10, 30, 60 et 90 μM et une période d’incubation de 72 h. La lignée cellulaire de carcinome ovarien humain A2780 s’est avérée être la plus sensible à la génistéine, suivie par HeLa. La prolifération n’a pas été significativement affectée pour les deux autres lignées cellulaires. Après incorporation dans les CD susmentionnés, des changements dans l’action antiproliférative se sont produits par rapport à la lignée cellulaire testée. La lignée cellulaire HeLa, adénocarcinome cervical, était plus sensible pour les trois complexes d’inclusion par rapport à la génistéine pure. Le même comportement a été constaté pour la lignée cellulaire A2780, sauf pour le complexe avec RAMEB. La complexation avec RAMEB a conduit à une augmentation de la CI50 également pour les lignées cellulaires MCF-7 et A431. Pour ces deux lignées cellulaires, la complexation de la génistéine avec l’HPBCD semble être la meilleure option. Dans la même étude, la génistéine et ses complexes CD ont été analysés par la méthode de diffusion sur disque d’agar et la méthode de dilution contre plusieurs souches bactériennes : Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. Les composés testés à la concentration de 10 mM ont présenté une activité antibactérienne uniquement pour B. subtilis. La dernière ligne de cette étude a été tirée vers des tests pour les effets antiangiogéniques employant la membrane chorioallantoïque de l’embryon de poulet. La génistéine pure a présenté des effets antiangiogéniques et le complexe HPBCD a montré une activité supérieure. De même pour les deux autres complexes, à savoir HPGCD et RAMEB pourrait être décrit un effet antiangiogénique mais un effet diminué comme évalué en appliquant le score 0-5 .
Une autre tentative pour augmenter la biodisponibilité de ce phytoestrogène lipophile a été dirigée vers la synthèse et l’analyse d’un dérivé ester de génistéine avec l’acide myristique et complexé avec la bêta cyclodextrine. La synthèse réussie du nouveau composé ainsi que l’inclusion réussie dans la bêta cyclodextrine ont été déterminées à l’aide de tests consacrés tels que l’analyse TLC, l’analyse HPLC, la spectroscopie FTIR, la spectroscopie MS, la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et la microscopie électronique à balayage (SEM). Les échantillons ont été testés in vitro, en utilisant le test de prolifération MTT sur trois lignées cellulaires humaines : HeLa-cervix adénocarcinome, A2780-carcinome ovarien et A431-carcinome épidermoïde cutané. Les résultats ont montré que, après une période d’incubation de 72 h aux concentrations de 10 et 30 µM, respectivement, la génistéine est un agent actif sur les lignées cellulaires HeLa (adénocarcinome du col de l’utérus) et A2780 (carcinome ovarien). Les nouvelles formulations n’ont pas diminué la viabilité des cellules cancéreuses. Ce comportement peut s’expliquer par la stabilité accrue du complexe dans l’environnement in vitro .
Une nouvelle formulation moderne explorée par l’industrie pharmaceutique, mais pas seulement, est celle des microstructures de polyuréthane (PM). Qu’est-ce qui nous a déterminé à nous intéresser à ces composés ? Selon la structure de la particule, une telle approche peut offrir : la possibilité de modifier la lipo ou la solubilité dans l’eau des structures d’inclusion, la protection contre les agents externes tels que les rayons UV, les environnements fortement acides ou alcalins, la délivrance de médicaments vers un récepteur spécifique ou le retardement de l’activité du composé biologiquement actif grâce à l’utilisation de véhicules de transport à faible vitesse de dégradation . Sur la base de ces hypothèses, nous avons synthétisé des PM avec un rendement d’encapsulation de 68,3% de génistéine (p/p). La formulation a été testée en vitrousant le test de prolifération MTT sur trois lignées cellulaires humaines de cancer du sein MCF7, MDA-MB-231 et T47D-lignées cellulaires d’adénocarcinome mammaire humain. Des tests ont également été réalisés pour l’activité antimicrobienne et antifongique contre les souches suivantes : S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella enteritidis, B. subtilis, Bacillus cereuset Candida albicansen utilisant la méthode de dilution. Les résultats nous ont permis de conclure que les PM sont un mauvais partenaire de transport in vitro pour la génistéine .
Des tests in vivo ont également été réalisés afin de tester les effets chimiopréventifs de la génistéine contre le mélanome murin. Au cours des recherches dans notre groupe, nous avons observé dans un modèle murin de mélanome, obtenu par injection sous-cutanée de 0,1 ml de 1*105 cellules B164A5/souris que, la génistéine après une période de 15 jours à une dose de 15 mg/kg, poids corporel a diminué le volume et le poids des tumeurs avec environ 30% et a réduit les tumeurs à distance. Des mesures non invasives utilisant le système d’adaptateur multi-sonde (MPA5) de Courage-Khazaka, Allemagne, Mexameter® MX 18 ont montré que la génistéine réduisait la quantité de mélanine et le degré d’érythème en corrélation directe avec le nombre de jours de traitement. Le lien entre inflammation et cancer étant très connu, nous avons analysé l’effet de la génistéine dans un modèle animal d’inflammation de l’oreille, seule et après incorporation dans l’hydroxypropyl-bêta-cyclodextrine (HPBCD) et la randomly-methylated-bêta-cyclodextrine (RAMEB). Les cyclodextrines (CD) sont des agents bien connus utilisés pour augmenter l’hydro solubilité des agents lipophiles actifs. L’étude a conclu que le phytoestrogène, à une dose de 2 mg peut être reconsidéré comme un composé naturel anti-inflammatoire actif sur le modèle animal d’inflammation C57BL/6 J. En outre, la complexation de la génistéine avec les CD susmentionnés a été réalisée et a conduit à un effet anti-inflammatoire plus fort. Dans une étude récente, pour tenter d’augmenter la biodisponibilité de ce phytoestrogène, nous avons adopté une nouvelle stratégie qui combine deux éléments : la formulation et la modalité d’administration. La formulation était un cristal liquide lyotrope lamellaire dans lequel la génistéine était incorporée à la concentration de 3% et la formulation a été appliquée localement, avec ou sans électroporation (EP), en utilisant le dispositif Mezoforte Duo Mez 120905-D sur C57BL6J. Les résultats ont montré que les tumeurs sont apparues plus tard lorsque l’électroporation était appliquée. Pendant les 21 jours de l’expérience, la génistéine incorporée dans la nouvelle formulation moderne, appliquée par voie topique classique, a diminué le volume de la tumeur, le degré d’érythème et la quantité de mélanine chez les souris portant des tumeurs de mélanome murin B16. Lorsque la formulation a été appliquée par électroporation, le pronostic était encore meilleur. Toutefois, cette nouvelle approche n’a eu aucun effet sur les concentrations sériques de la protéine S100B et de l’énolase spécifique des neurones (NSE), ni sur l’expression tissulaire de l’anticorps du récepteur β du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRβ). De plus, l’extrait total de soja incorporé dans la nouvelle formulation moderne de cristaux liquides lyotropes lamellaires a été testé in vitro sur la lignée cellulaire de mélanome de souris B164A5 pour son potentiel pro-apoptotique, en utilisant deux tests consacrés : le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et la double coloration annexine-FITC-7AAD. 200 μg/ml d’extrait de soja, respectivement 200 μg/ml d’extrait de soja incorporé dans la formulation liquide cristalline lyotrope lamellaire ont été incubés pendant 72 h avec cette lignée cellulaire de mélanome murin. Les résultats ont montré que l’extrait de soja a des propriétés pro-apoptotiques et que l’incorporation dans la nouvelle formulation n’affecte pas de manière négative cet effet, ce qui en fait un excipient approprié pour les études in vivostudies. Dans une étude récente, la diffusion et la pénétration de la génistéine, respectivement, de la génistéine incorporée dans une formulation cristalline liquide lyotrope lamellaire à travers différentes membranes (une membrane synthétique in vitro, une membrane chorioallantoïque de poulet (CAM) ex ovo, et un épiderme humain excisé ex vivo) ont également été étudiées par un traitement conventionnel sans PE, et également avec la médiation de PE à l’aide d’un système de cellules de diffusion Franz. La spectroscopie RTA-FTIR in vivo et la spectroscopie Raman ex vivo ont été appliquées afin d’analyser l’effet sur la peau des souris. Les résultats ont montré que la nouvelle formulation est un support approprié pour la génistéine lipophile. La formulation avec l’agent actif a pénétré la peau, mais lorsque l’électroporation a été appliquée, le transport transdermique du médicament était plus rapide et plus efficace. Cette observation a été validée par la spectroscopie ATR-FTIR et Raman.
La recherche de notre groupe sur le phyto-œstrogène génistéine pointe vers la conclusion claire que ce phytocomposé est un agent chimiopréventif actif contre le mélanome malin à la fois in vitroet in vivo. Une série de tentatives ont été faites afin d’augmenter la biodisponibilité de ce composé lipophile. Nous ne pouvons pas dire que nous avons trouvé la formulation optimale, mais nous avons réussi à améliorer les résultats par rapport à la substance pure. D’autres études seront menées sur cette question.