PMC

Raport przypadku

44-letnia kobieta zaczęła stosować L-TRP (1500 mg dziennie) w styczniu 2009 roku z powodu bezsenności. W 2007 roku przeszła operację odchudzania z powodu otyłości, po której w ciągu 12 miesięcy schudła 140 funtów. Zażywała L-TRP, sprzedawany pod nazwą handlową „Uber rest”, dystrybuowany przez firmę Heartland Products, który zakupiła w aptece w Chicago. Oprócz L-TRP stosowała również L-karnitynę, olej lniany i kwas alfa-liponowy, ale nie przyjmowała żadnych leków. W ciągu trzech tygodni od rozpoczęcia stosowania L-TRP u pacjentki wystąpił obrzęk kończyn górnych i dolnych, a następnie silny ból mięśni i osłabienie. W ciągu następnych czterech tygodni zauważyła postępujące stwardnienie skóry na kończynach górnych i dolnych, ale bez palców u rąk i nóg. W badaniu fizykalnym w sierpniu 2009 roku zauważono drzewkowate stwardnienie skóry przedramion i nóg (ryc. 1A). Palpacja proksymalnych części kończyn wywoływała mialgię. Badanie manualne mięśni wykazało siłę 4/5 stopnia Medical Research Council w proksymalnych mięśniach kończyn górnych i dolnych oraz prawidłową siłę w mięśniach dystalnych. Badanie nerwów czaszkowych, czucia i odruchów było prawidłowe.

Prezentacja kliniczna SZO

A. Widoczne jest stwardnienie i obrzęk skóry lewego ramienia, obecne również w obu kończynach górnych i dolnych z wyczuwalnym pogrubieniem powięzi. B. Osiowe obrazy rezonansu magnetycznego uda z sekwencją STIR ujawniły wysoką intensywność sygnału w powięzi otaczającej mięśnie przedziału przedniego i tylnego (strzałki). C. Tomografia komputerowa klatki piersiowej o wysokiej rozdzielczości ukazująca zmiany szkliste i zmętnienie przestrzeni powietrznych w lewym płucu (strzałka).

Badania laboratoryjne wykazały podwyższoną liczbę białych krwinek (WBC) z 24% eozynofilów (bezwzględna liczba 1600 komórek/mm3). Stężenie aldolazy w surowicy było lekko podwyższone, ale stężenie kinazy kreatynowej (CK) było prawidłowe. Wyniki następujących badań były ujemne lub prawidłowe: przeciwciała przeciwjądrowe, przeciw dwuniciowemu DNA, przeciw cytoplazmie neutrofili, przeciwciała anty-Ro, anty-La, anty-Scl-70 i anty-CCP, czynnik reumatoidalny, wskaźnik sedymentacji erytrocytów, immunofiksacja surowicy, hormon stymulujący tarczycę i albuminy. Badanie przewodnictwa nerwowego (NCS) wykazało prawidłowe odpowiedzi ruchowe i czuciowe w kończynach górnych i dolnych. Elektromiografia (EMG) mięśni proksymalnych wykazała dowody w postaci małej amplitudy, krótkiego czasu trwania, polifazowych potencjałów jednostek motorycznych z wczesną rekrutacją, co przemawia za obecnością procesu miopatycznego. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) ud wykazało obrzęk mięśni i powięzi (ryc. 1B). Tomografia komputerowa wysokiej rozdzielczości (HRCT) klatki piersiowej ujawniła szkliste zmętnienie w lewym płucu (ryc. 1C). Biopsje skóry, powięzi vastus lateralis i mięśni pobrane przed rozpoczęciem immunoterapii wykazały zmiany histopatologiczne charakterystyczne dla EMS (ryc. 2). Wyniki barwienia immunologicznego przeciwciałami przeciwko produktom degranulacji eozynofilów: białku podstawowemu major (MBP) i neurotoksynie pochodzącej z eozynofilów (EDN) były silnie dodatnie (ryc. 2 H, I). Typowanie HLA-DR ujawniło, że pacjent miał allel HLA-DRB1*04, czynnik ryzyka wśród osób stosujących L-TRP dla rozwoju EMS (OR 3,9, 95% CI 1,1-16,4), oraz brak któregokolwiek ze zgłoszonych ochronnych alleli HLA.12

Zapalenie tkanek, zwłóknienie i degranulacja eozynofilów

Próbki biopsji skóry (A) i mięśni (B – I) barwione hematoksyliną i eozyną (A – F), trichromem Gomoriego (G) oraz przeciwciałami przeciwko neurotoksynie pochodzącej z eozynofilów (EDN) (H) i głównemu białku podstawowemu (MBP) (I). A. Włóknienie skóry z nagromadzeniem kolagenu w skórze właściwej i naciekiem eozynofilów (strzałka). B. Próbka powięzi i mięśni wykazuje gęste zwłóknienie powięzi naskórkowej (ciemna strzałka) i zanikowe powięzi mięśniowe (biała strzałka). C. Większe powiększenie ujawnia rozproszone włókna martwicze (strzałka). D – G. Naciek zapalny (strzałki) w tkance łącznej okołomięśniowej (D), tkance łącznej śródmięśniowej (E), wokół nerwu śródmięśniowego (F) i wokół śródmięśniowych naczyń krwionośnych (G). Eozynofile były wykrywane rzadko. H, I. Analiza immunofluorescencyjna. Barwienie EDN (H) i MBP (I) jest obecne w tkance łącznej okołomięśniowej i śródmięśniowej, jak również wokół śródmięśniowego naczynia krwionośnego i nerwu (nie pokazano).

Mimo że L-TRP spożyty przed wystąpieniem objawów nie był już dostępny, wiele równoległych próbek z tej samej partii poddano wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) ze spektrometrią mas.13. W żadnej z próbek nie wykryto zanieczyszczeń w stężeniu większym niż 10 ppm. W szczególności, nie wykryto hydroksylowanej pochodnej tryptofanu piku C (EBT), piku E (PAA), piku FF 2-(2-hydroksyindoliny)-Trp lub 2-(3-indolilo)-L-tryptofanu (dane nie pokazane).

Za świadomą zgodą zatwierdzoną przez Northwestern University’s Institutional Review Board, pobrano pojedynczą 3 mm biopsję punkcyjną skóry z klinicznie dotkniętego przedramienia do analizy mikromacierzy. W czasie wykonywania biopsji pacjent przyjmował prednizon (50 mg/d) i mykofenolan mofetylu (1000 mg/bid). Homogenizację biopsji skóry przeprowadzono w urządzeniu Qiagen TissueLyser, a całkowite RNA izolowano przy użyciu zestawów RNeasy for fibrosis tissue z automatyzacją w Qiagen QIAcube. Znakowane RNA ze zmienionej chorobowo skóry hybrydyzowano konkurencyjnie do 44 000-elementowych mikromacierzy oligonukleotydowych firmy Agilent reprezentujących 33 000 znanych i nowych genów ludzkich.14 Próbki badano w trzech egzemplarzach i porównywano z trzema niezależnymi biopsjami skóry zdrowych kobiet, dopasowanymi pod względem miejsca anatomicznego i wieku. Surowe dane mikromacierzy zostały zdeponowane w National Center for Biotechnology Information’s Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo); numer akcesji: GSE26934. Geny ulegające różnej ekspresji pomiędzy zdrowymi kontrolami a biopsjami skóry EMS zidentyfikowano przy użyciu analizy istotności mikromacierzy (SAM). Porównanie ekspresji genów w biopsji skóry EMS i biopsji kontrolnej (Ryc. 3) pozwoliło zidentyfikować 343 geny, których ekspresja różniła się w sposób istotny (SAM, współczynnik fałszywego odkrycia ≤ 0,64%). Geny wykazujące zwiększoną ekspresję w biopsji EMS obejmowały liczne kolageny (kolagen V, kolagen VI, kolagen VIII, kolagen XII), cząsteczki macierzy pozakomórkowej (fibronektyna, tenascyna C, COMP1, elastyna, lumikan i Cyr 61), oksydazę lizylową, PAI-1, trombospondynę, kadherynę 11, TIMP-1 oraz liczne integryny i kadheryny, a także geny związane z sygnalizacją TGF-ß, IL-4 i IL-13.15

Geny ulegające różnej ekspresji w biopsji skóry EMS w stosunku do zdrowych kontroli

Ekspresja genów była mierzona w biopsji skóry EMS w trzech egzemplarzach oraz w trzech niezależnych biopsjach normalnej skóry kontrolnej dopasowanych pod względem płci, wieku i miejsca anatomicznego. Wszystkie próbki zostały pobrane z lewego przedramienia. 343 różnie wyrażone geny zostały wybrane przy użyciu analizy istotności mikromacierzy (FDR = 0,64%). Wybrane geny są zaznaczone, a te omówione w tekście są pogrubione. Pełna rycina z wszystkimi nazwami genów jest dostępna jako uzupełniająca Figura S3.

Aby ustalić, czy szlaki TGF-β, IL-4 i IL-13, z których każdy jest implikowany w zwłóknieniu, były znacząco różnie regulowane w biopsji skóry EMS, przeprowadzono analizę wzbogacania zestawów genów przy użyciu eksperymentalnie zdefiniowanych zestawów genów.15. Wszystkie zmierzone geny zostały uszeregowane według ich korelacji z idealizowanym rozróżnieniem między fenotypem zdrowym a fenotypem EMS (ryc. uzupełniające S1A i S2A). Następnie porównaliśmy uszeregowane listy genów szlaków z listami losowo wybranych genów (Ryc. Uzupełniające S1B i S2B). Każda ścieżka otrzymała Enrichment Score (ES), który mierzy statystyczną istotność różnicowej ekspresji. Aby określić, czy istnieje znaczący związek z fenotypem choroby, wartość p dla ES została obliczona przez permuting etykiet tablicy i ES została ponownie obliczona (Supplemental Figure S1C i S2C). W celu oszacowania FDR porównaliśmy ES eksperymentalnie wyznaczonej ścieżki do tej znalezionej z losowo wybranymi podzbiorami genów o tym samym rozmiarze (Supplemental Figure S1D i S2D). W ten sposób oceniamy, jak prawdopodobne jest znalezienie ES porównywalnego z prawdziwym ES, jeśli ścieżka jest rzeczywiście niezwiązana z chorobą. Zarówno ścieżka TGF-β (ES 0,3729), jak i IL-4 (ES 0,2428) były istotnie podwyższone przy p-wartościach i FDR <0,001. Ścieżka IL-13 (ES 0,2370) była również zwiększona, z niskim FDR (0,0032), ale wysokim p-value (p-value = 0,125). Sugeruje to, że podczas gdy szlak IL-13 wykazał dowody na wzrost regulacji, może nie być odpowiedzialny za rozróżnienie pomiędzy skórą EMS a zdrową skórą kontrolną.

Ale leczenie prednizonem i mykofenolanem spowodowało umiarkowaną poprawę siły mięśni proksymalnych i mialgii wraz z szybkim rozwiązaniem eozynofilii krwi obwodowej i zmętnieniami w tomografii komputerowej, stwardnienie skóry i neuropatia postępowały. Powtórne badanie NCS wykazało zmniejszenie lub brak amplitudy odpowiedzi czuciowej i ruchowej, co wskazywało na nową zależną od długości aksonalną polineuropatię czuciowo-ruchową kończyn górnych i dolnych. Dodanie metotreksatu (20 mg tygodniowo przez 5 miesięcy), a następnie codzienne wstrzyknięcia anakinry przez 3 miesiące nie przyniosły dalszej poprawy w zakresie mialgii, neuropatii lub stwardnienia skóry.