Novas visões sobre os potenciais benefícios para a saúde das isoflavonas

Das principais isoflavonas referidas acima, estudámos a genisteína. Uma das linhas mais importantes do nosso grupo de investigação sobre este tópico envolve a análise do efeito quimiopreventivo da genisteína fitoestrogénica contra o melanoma maligno. A genisteína isoflavonóide (4′,5,7-tri-hidroxiisoflavona) é o aglycone da genistina heterósida. É o composto mais estudado da classe das isoflavonas juntamente com daidzeína, glicina, formononetina, equol e biochanina A. É o principal composto activo das sementes de soja, Glycine max(L.) Merr., família Fabaceae. Relativamente às actividades biológicas, artigos recentes relatam que: a genisteína induz apoptose, inibe a proliferação celular, modula a progressão do ciclo celular em diferentes linhas celulares cancerosas, inibe a angiogénese, suprime a activação e proliferação linfocitárias, estabiliza os mastócitos e apresenta ligeiras propriedades anti-inflamatórias. O fitoestrogénio também inibe a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), que está directamente correlacionada com a modificação do ADN e os danos nos tecidos. A produção de ROS, especialmente por células activadas do sistema imunitário, foi postulada a desempenhar um papel importante na carcinogénese, particularmente na promoção tumoral .

Num estudo complexo recente que empregou as linhas celulares de melanoma murino B164A5 e B16F10, mostrámos testar uma vasta gama de concentrações (150, 100, 50, 30, 15, 5 e 1 µM) que este fitocomposto é um agente antiproliferativo activo e pró-apoptótico nestas duas linhas celulares. O ensaio MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) mostrou um ensaio de IC50 de 41,1 µM genisteína para células B164A5 e 61,4 µM genisteína para células B16F10. O ensaio de carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) mostrou que após 24 h de incubação, a proliferação de células B16 foi diminuída quando tratada com 30 μM genisteína. A genisteína a 100 µM foi capaz de causar a paragem de G2/M no ciclo celular destas linhas celulares de melanoma murino. Foi realizada uma coloração DAPI para detectar os primeiros sinais de apoptose. Quando as células B16 foram incubadas com 100 μM genistein, este fenómeno pôde ser detectado e traduzido por uma redução do número de células e aumento da fragmentação nuclear em comparação com o grupo de controlo . A análise da mancha ocidental foi ainda mais conduzida, para quatro proteínas importantes envolvidas no processo de apoptose, nomeadamente caspase 3, poli(ADP-ribose) polimerase (PARP), Bax e Bcl-2. Incubação com 100 μM genisteína conduzida para ambas as linhas celulares B16 a caspase-3 clivada, bem como PARP clivada como responsável pelo mecanismo de eventos apoptóticos. Num outro estudo utilizando todas as concentrações previamente testadas (150, 100, 50, 30, 15, 5 e 1 µM genistein) e após um período de incubação de 72 h, demonstrámos que o fitoestrogénio não induz a activação da caspase-2 in vitroon das linhas celulares de melanoma B16. A fim de obter o quadro completo sobre a apoptose, nomeadamente para detectar células apoptóticas precoces e tardias, a coloração da anexina V-FITC/7AAD foi realizada por citometria fluorescente em paralelo para as células do melanoma B16, bem como para as células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs). Na sua concentração mais elevada, a genisteína induziu eventos ligeiramente mais apoptóticos nas células B16 do que nos BMDCs. O objectivo do estudo acima mencionado era encontrar um fármaco que “mata” as células cancerosas e estimula a actividade imunitária. Com este objectivo, a potencial actividade imunitária estimulante da genisteína foi testada através da medição da citocina anti-tumorigénica IL-12p70 libertada pelos BMDCs murinos primários. O fitoestrogénio, na concentração de 5 μM, diminuiu o nível de IL-12p70 dos CD estimulados por LPS. Estas descobertas estavam de acordo com a observação de que também os níveis de mRNA IL-12p35 foram reduzidos. A actividade das células T foi ainda analisada analisando a concentração de IFN-γ e IL-2 citocina no sobrenadante de células do baço de ratos OT I que exprimem os receptores de células T transgénicas específicas da ovalbumina. Os resultados mostraram que a genisteína não teve qualquer efeito sobre a concentração de IFN-γ e IL-2 citocinas.

Beside a actividade quimiopreventiva do melanoma murino, o nosso grupo de investigação investigou a genisteína por si só e incorporou na metilação aleatória β-cyclodextrin (RAMEB), hidroxipropil-β-cyclodextrin (HPBCD) e hidroxipropil-γ-cyclodextrin (HPGCD) numa razão molar 1:1 para uma série de actividades biológicas. Esta abordagem foi escolhida a fim de aumentar a solubilidade em água deste composto lipofílico. Os CDs são ciclo-oligosacáridos que apresentam um lado exterior hidrofílico e um lado interior hidrofóbico com a capacidade de formar complexos de inclusão de hóspedes-hospedeiros com um número crescente de estruturas químicas . Em primeiro lugar, foram efectuados cálculos químicos quânticos analisando o comportamento em fase gasosa, em água e em sulfóxido de dimetilo, o solvente utilizado para a solubilização de agentes activos em todos os ensaios mencionados. Adicionalmente, foi provado que a incorporação de genisteína nos CDs acima mencionados teve lugar através de uma série de técnicas consagradas, tais como estudos de solubilização de fase, calorimetria diferencial de varrimento (DSC), difracção de raios X e ensaios de microscopia electrónica de varrimento (SEM) . A genisteína e os seus complexos de inclusão foram estudados in vitro em quatro tipos de linhas de células cancerosas tais como HeLa (adenocarcinoma cervical), MCF-7 (adenocarcinoma da mama), A2780 (carcinoma ovariano humano) e A431 (carcinoma epidermoide cutâneo) linhas de células utilizando as seguintes concentrações: 1, 3, 10, 30, 60 e 90 μM e um período de incubação de 72 h. A2780 carcinoma de ovário humano, comprovado como sendo o mais sensível à genisteína, seguido de HeLa. A proliferação não foi significativamente afectada para as outras duas linhas celulares. Após incorporação nos CDs acima mencionados, ocorreram alterações na acção antiproliferativa em relação à linha de células testadas. A linha celular de adenocarcinoma cervical HeLa foi mais sensível para os três complexos de inclusão quando comparada com a genisteína pura. O mesmo comportamento foi encontrado para a linha de células A2780, excepto para o complexo com RAMEB. A complementação com RAMEB conduziu a um IC50 aumentado também para as linhas de células MCF-7 e A431. Para estas duas linhas de células, a complexação da genisteína com HPBCD parecia ser a melhor opção . No mesmo estudo, a genisteína e os seus complexos de CD foram analisados pelo método de difusão em disco de ágar e o método de diluição contra várias estirpes bacterianas: Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Os compostos testados na concentração de 10 mM apresentaram actividade antibacteriana apenas para B. subtilis. A última linha deste estudo foi traçada para testes de efeitos antiangiogénicos utilizando a membrana corioalantóica do embrião de galinha. A genisteína pura apresentou efeitos antiangiogénicos e o complexo HPBCD mostrou uma actividade superior. Também para os outros dois complexos, nomeadamente HPGCD e RAMEB, poderia ser descrito um efeito antiangiogénico, mas um decrescido conforme avaliado através da aplicação da pontuação 0-5 .

Outra tentativa de aumentar a biodisponibilidade deste fitoestrogénio lipofílico foi direccionada para a síntese e análise de um derivado éster de genisteína com ácido mirístico e complexado com beta ciclodextrina. A síntese bem sucedida do novo composto bem como a inclusão bem sucedida na beta ciclodextrina foi determinada utilizando ensaios consagrados como a análise TLC, análise HPLC, espectroscopia FTIR, espectroscopia MS, calorimetria diferencial de varrimento (DSC) e microscopia electrónica de varrimento (SEM). As amostras foram testadas in vitro, utilizando o ensaio de proliferação de MTT em três linhas de células humanas: Adenocarcinoma de HeLa-cervix, carcinoma A2780-ovário e carcinoma A431- epidermoide de pele. Os resultados mostraram que, após um período de incubação de 72 h nas concentrações de 10 e 30 µM, respectivamente, a genisteína é um agente activo nas linhas celulares de HeLa (adenocarcinoma do colo do útero) e A2780 (carcinoma do ovário). As novas formulações não diminuíram a viabilidade das células cancerosas. Este comportamento pode ser explicado pelo aumento da estabilidade do complexo dentro do ambiente in vitro .

Uma nova formulação moderna explorada pela indústria farmacêutica, mas não só, são as microestruturas de poliuretano (PM). O que nos determinou a concentrarmo-nos nestes compostos? Dependendo da estrutura da partícula, tal abordagem pode oferecer: a possibilidade de alterar a lipossolubilidade ou a hidrossolubilidade das estruturas de inclusão, protecção contra agentes externos tais como radiação UV, ambientes fortemente ácidos ou alcalinos, fornecimento de medicamentos para um receptor específico ou actividade retardada do composto biologicamente activo devido à utilização de veículos de transporte com baixa velocidade de degradação . Com base nestas hipóteses, sintetizámos o PM com um rendimento de encapsulação de 68,3% de genisteína (p/p). A formulação foi testada in vitro utilizando o ensaio de proliferação MTT em três linhas de células humanas de cancro da mama MCF7, MDA-MB-231 e T47D – linhas de células humanas de adenocarcinoma da mama. Foram também realizados testes para a actividade antimicrobiana e antifúngica contra as seguintes estirpes: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella enteritidis, B. subtilis, Bacillus cereus e Candida albicansempregando o método de diluição. Os resultados levaram-nos a concluir que o PM é um mau parceiro in vitrocarrier para a genisteína .

In vivoassays foram também realizados a fim de testar os efeitos quimiopreventivos da genisteína contra o melanoma murino. Durante a investigação no nosso grupo, observámos num modelo de melanoma murino, obtido por injecção subcutânea de 0,1 ml de 1*105 B164A5 células/mouse que, genisteína após um período de 15 dias com uma dose de 15 mg/kg, o peso corporal diminuiu o volume e o peso do tumor com cerca de 30% e reduziu os tumores de distância. Medidas não invasivas utilizando o Sistema de Adaptador Multi-sondas (MPA5) de Courage-Khazaka, Alemanha, Mexameter® MX 18 mostrou que a genisteína reduziu a quantidade de melanina e o grau de eritema directamente correlacionado com o número de dias de tratamento . Sendo muito bem conhecida, a ligação entre inflamação e cancro, analisámos o efeito da genisteína apenas num modelo animal de inflamação do ouvido e após incorporação em hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPBCD) e aleatoriamente metil-beta-ciclodextrina (RAMEB). As ciclodextrinas (CD) são agentes bem conhecidos utilizados para aumentar a hidrossolubilidade dos agentes lipofílicos activos . O estudo concluiu que o fitoestrogénio, na dose de 2 mg pode ser reconsiderado como um composto natural activo anti-inflamatório em C57BL/6 J modelo animal de inflamação. Além disso, a complexação da genisteína com os CDs acima mencionados foi feita e levou a um efeito anti-inflamatório mais forte . Num estudo recente, a fim de tentar aumentar a biodisponibilidade deste fitoestrogénio, adoptámos uma nova estratégia que combina dois elementos: a formulação e a modalidade de administração. A formulação foi um cristal líquido liotrópico lamelar no qual a genisteína foi incorporada à concentração 3% e a formulação foi aplicada localmente, com ou sem electroporação (EP), utilizando o dispositivo Mezoforte Duo Mez 120905-D em C57BL6J. Os resultados mostraram que os tumores apareceram mais tarde, quando a electroporação foi aplicada. Durante os 21 dias da experiência, a genisteína incorporada na nova formulação moderna, aplicada topicamente clássica, diminuiu o volume do tumor, o grau de eritema e a quantidade de melanina para ratos com tumores de melanoma murino B16. Quando a formulação foi aplicada por electroporação, o prognóstico era ainda melhor. Contudo, a nova abordagem não teve qualquer efeito em termos de concentrações séricas da proteína S100B e enolase sérica específica de neurónio (NSE), ou a expressão tecidual do receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas β (PDGFRβ) anticorpo . Além disso, o extracto total de soja incorporado na nova formulação moderna de cristal líquido liotrópico lamelar foi testado in vitro na linha celular de melanoma de rato B164A5 pelo seu potencial pró-apoptótico, empregando dois ensaios consagrados: 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e a coloração dupla do anexo do FITC-7AAD. 200 μg/ml de extracto de soja, respectivamente 200 μg/ml de extracto de soja incorporado na formulação cristalina líquida liotrópica lamelar foram incubados durante 72 h juntamente com esta linha de células de melanoma murino. Os resultados mostraram que o extracto de soja tem propriedades pró-apoptóticas e a incorporação na nova formulação não afecta de forma negativa este efeito, sendo assim um excipiente adequado para in vivotudies . Num estudo recente, a difusão e penetração de genisteína, respectivamente, genisteína incorporada em formulação líquida liotrópica lamelar cristalina através de diferentes membranas (uma membrana sintética in vitro, membrana corioalantoica de pintinho (CAM) ex ovo, e epiderme humana excisada ex vivo) foram também investigadas por tratamento convencional sem EP, e também com a mediação de EP com a ajuda de um sistema de células de difusão de Franz. A espectroscopia in vivoATR-FTIR e ex vivoRaman foram aplicadas a fim de analisar o efeito sobre a pele dos ratos . Os resultados mostraram que a nova formulação é um portador adequado para a genisteína lipófila. A formulação com o agente activo penetrou na pele, mas quando a electroporação foi aplicada, o transporte transdérmico da droga foi mais rápido e eficaz. Esta observação foi validada pela espectroscopia ATR-FTIR e Raman .

A investigação do nosso grupo sobre a genisteína de fitoestrogénio aponta para a conclusão clara de que este fitocomposto é um agente quimiopreventivo activo contra melanoma maligno tanto in vitro como in vivo. Foram feitas uma série de tentativas para aumentar a biodisponibilidade deste composto lipofílico. Não podemos dizer que tenhamos encontrado a formulação ideal, mas conseguimos melhorar os resultados em comparação com a substância pura. Outros estudos serão conduzidos sobre este assunto.