Morphological diversity of blastula formation and gastrulation in temnopleurid sea urchins | Biology Open

DISCUSSION

W niniejszym opracowaniu struktury blastuli i gastruli wykazały cechy gatunkowe wśród czterech temnopleuridów (ryc. 1-4). Kształt i położenie (wegetatywne lub boczne) blastomerów w blastuli różniły się między gatunkami. Luźno przylegające do siebie blastomery na ścianie blastuli u T. toreumaticus miały kształt kulisty aż do stadium pomarszczonej blastuli (ryc. 1). U T. toreumaticus liczba komórek w momencie wylęgania wynosi zaledwie 500, podczas gdy u innych gatunków 600-800 (Masuda, 1979). Ponieważ średnica blastuli jest podobna u tych gatunków (Kitazawa i in., 2010), sugerujemy, że mniejsza liczba rozszczepień powoduje różnice w kształcie komórek i adhezji między blastomerami w tym samym stadium rozwojowym. Tworzenie się pomarszczonych blastuli znane jest tylko u bezpośrednio rozwijających się gatunków jeżowców (Henry i in., 1991). Jednak zarodki T. toreumaticus, mimo że jest gatunkiem rozwijającym się pośrednio, tworzą pomarszczone blastule (Kitazawa i in., 2009, 2010). Za cechy i przyczyny powstawania zmarszczek u osobników bezpośrednio rozwijających się, takich jak Heliocidaris erythrogramma, uważa się, że ich zarodki rozwijają się w wąskiej przestrzeni perywitelinowej i tworzą zmarszczki w zależności od wczesnej linii komórkowej, ich blastomery słabo przylegają, a pomarszczone blastule uwalniają do blastocelu małe kropelki lipidów (Henry i in., 1991). Wyniki obecnych i poprzednich badań (Kitazawa i in., 2009, 2010) są zbieżne z mechanizmem bezpośrednich twórców, z wyjątkiem uwalniania lipidów. Zaobserwowano jednak, że w blastocelu zarodków T. toreumaticus zamiast lipidów znajdowały się granulki ECM (ryc. 1B). Zarodki tego gatunku wykazują pewne odmienne cechy w porównaniu z innymi temnopleuridami i różnice te mogą być również inną przyczyną tworzenia się pomarszczonej blastuli.

Blastule badanych temnopleuridów mają blastomery z różnymi rodzajami struktur pseudopodopodobnych (ryc. 1-4). U T. toreumaticus blastomery wokół przypuszczalnych PMCs przedłużały do nich pseudopodia (ryc. 1G,H). Immers (1961) wskazał, że u jeżowców tworzenie filopodialnych występów komórek mezenchymy jest wspomagane przez macierz złożoną z siarczanowanych polisacharydów połączonych z białkami. Różnice w kształcie struktur pseudopodporowych wśród temnopleurydów mogą być spowodowane różnymi substancjami w obrębie macierzy. Ostatnio Yaguchi i wsp. (2015) wskazali, że adhezja między blastomerami we wczesnych rozszczepieniach była bardzo luźna, a blastomery miały wiele wypukłości przyczepionych do zewnętrznej ECM i warstwy hialinowej w bruździe rozszczepienia u T. reevesii. Ponadto, trudno było podzielić każdy blastomer wczesnych zarodków T. hardwickii i M. globulus ze względu na zewnętrzną ECM i warstwę hialinową (dane nie pokazane). Jednak w naszych obserwacjach blastuli, przestrzeń między blastomerami stała się wąska i połączona przez złożone struktury pseudopodporowe (Rys. 2). Blastomery wokół domniemanych PMCs wydawały się tworzyć warstwy z wydłużonych struktur pseudopod-podobnych (Fig. 2I). Zjawiska te wskazują, że adhezja między blastomerami zmienia się z luźnej na ścisłą. W przyszłych pracach należy przeanalizować, czy wczesne wypustki tworzą struktury pseudopodopodobne na etapie blastuli.

Rozmieszczenie ECMs było różne u poszczególnych gatunków i w zależności od położenia (wegetatywne lub boczne). Na powierzchni blastocelu rozwija się wiele rodzajów ECMs, do których należą mukopolisacharydy (Okazaki i Niijima, 1964), glikoproteiny fibronektyna i laminina (Spiegel i in., 1983; Benson i in., 1999) oraz kolagen (Kefalides i in., 1979; Crise-Benson i Benson, 1979). Ponadto w blaszce podstawnej rozmieszczenie fibronektyny i lamininy różni się w zależności od gatunku (Spiegel i in., 1983; Katow i in., 1982). Na blastocelulozowej powierzchni blaszki wegetatywnej T. toreumaticus znajdowała się struktura ECM przypominająca otwór (ryc. 1G,H). Nie występowała ona u pozostałych gatunków (ryc. 2-4). U Lytechinus variegatus powierzchnie blastoceliczne przed ingresją PMC pokryte były cienką blaszką podstawną złożoną z materiałów włóknistych i niewłóknistych, a następnie na półkuli zwierzęcej pojawiła się ECM przypominająca pajęczynę (Galileo i Morrill, 1985). Galileo i Morrill (1985) stwierdzili, że blastomery, przed wykluciem na ścianie blastocelu, były splecione ze sobą i miały mozaikowatą siateczkę ECM. Były one połączone cienkimi wyrostkami komórkowymi ze sobą prostopadle do osi zwierzęco-wegetatywnej. Ponadto ściana blastocelu wokół półkuli zwierzęcej wykształciła otwór bez ECM. Ostatnio doniesiono, że presumptive PMCs tracą dystrybucję lamininy związaną z podobwodem sieci regulacyjnej genów dla remodelingu blaszki podstawnej, które obejmują tbr, dri i hex przez knockdown tych genów (Saunders i McClay, 2014). Dlatego sugerujemy, że struktura przypominająca dziurę obserwowana u T. toreumaticus może być utworzona z lamininy dodanej przez te geny, a embriony temnopleurydów w naszym badaniu mogą mieć różną ilość i dystrybucję lamininy. Analiza opublikowanych przez Amemiya (1989) zdjęć Hemicentrotus pulcherrimus i Pseudocentrotus depressus wykazała, że blastomery strony zwierzęcej wydłużają się do bieguna wegetatywnego. Jednakże zarodki te nie tworzyły w ECM otworu wegetatywnego. Co więcej, Amemiya (1989) donosi, że patterning PMC jest spowodowany akumulacją fibryli laminy podstawnej. To doniesienie potwierdza nasze spostrzeżenia, że otwór ECM T. toreumaticus może przyczepiać PMC do płytki wegetatywnej. Utrwalacz użyty w naszych badaniach był bardzo podobny do metody bez jonów wapnia w Amemiya (1989). Dlatego też nasze wyniki mogą wskazywać, że istnieją różnice w dystrybucji ECM zależnej od wapnia wśród gatunków i że T. toreumaticus ma dużo ECM zależnej od wapnia lub ECM niezależnej od wapnia.

W M. globulus, każdy blastomer blastuli znalazł się blisko powierzchni wraz z włóknistymi strukturami wokół ósmego rozszczepienia. Arkuszowa struktura mukopolisacharydów na powierzchni blastocelu została zidentyfikowana dla ruchu SMCs na tych strukturach (Endo i Uno, 1960). W naszych badaniach nie zidentyfikowaliśmy dobrze rozwiniętych struktur włóknistych w blastulach M. globulus, ale zaobserwowaliśmy pewne ECMs na powierzchni blastocelu (Rys. 4E). Endo (1966) podał, że u Mespilia podczas wnikania PMCs pozbywają się swojej apikalnej cytoplazmy, będąc wciąż przyczepionymi przez desmosomy do sąsiednich komórek. Z drugiej strony, u Arbacia (Gibbins i in., 1969) i Lytechinus pictus (Katow i Solursh, 1980) desmosomy znikają z PMCs. Dlatego analiza ultrastruktury ściany blastularnej u tych temnopleurydów jest konieczna w przyszłości.

Ecms jest ważny dla ruchu komórek, takich jak migracja PMC do różnicowania PMC, modulacji polarności komórek nabłonkowych i gastrulacji (Solursh i Lane, 1988; Katow i in., 1982; Fink i McClay, 1985; Amemiya, 1989; Adelson i Humphreys, 1988; Ingersoll i Ettensohn, 1994; Berg i in., 1996). U L. pictus, PMCs posiadają sześć typów wyrostków komórkowych, zależnych od specyficznego komponentu podłoża blaszki podstawnej, które są zaangażowane w zachowanie migracyjne komórek (Katow i Solursh, 1981). W naszych badaniach PMCs T. reevesii, T. hardwickii i M. globulus wnikały do wnętrza oddzielnie. Sugerujemy, że u T. toreumaticus masowa ingresja PMC może być spowodowana wewnętrzną dystrybucją ECM w blaszce wegetatywnej. Zaobserwowaliśmy również pewnego rodzaju struktury procesualne (Ryc. 1-4) i sugerujemy, że struktury te mogą powodować ruch komórek.

Gastrulacja u T. reevesii, T. hardwickii i M. globulus odbywa się poprzez stopniową inwazjację z okresem opóźnienia (Ryc. 2-5). Oznacza to, że mechanizm gastrulacji u tych temnopleurydów może być inny niż u T. toreumaticus, u którego inaginacja ma charakter ciągły. Chociaż czas rozpoczęcia inwaginacji u T. toreumaticus i M. globulus w naszym badaniu różnił się od tego podanego przez Takata i Kominami (2004), sugeruje to, że różnice pomiędzy partiami zarodków lub lokalizacją geograficzną (obszar Yamaguchi w niniejszym badaniu; obszary Kouchi i Ehime w Takata i Kominami, 2004) tego samego gatunku mogą powodować różne tempo rozwoju zarodków.

Mechanizmy inwazji archenteronu każdego gatunku rozpatrywano według czterech czynników: wepchnięcie komórek wegetatywnych do blastocelu przez wzrost komórek na biegunie zwierzęcym (Takata i Kominami, 2001), wydłużenie komórek tworzących archenteron, ponowne ułożenie komórek tworzących archenteron wzdłuż osi zwierzęco-wegetatywnej oraz hartowanie rudymentu jelitowego przez filopodia SMCs wnikające do blastocelu z wierzchołka archenteronu (Ettensohn, 1985; Hardin, 1988; Dan i Okazaki, 1956; Gustafson i Kinnander, 1956; tab. 2). U T. toreumaticus blastopory stają się wąskie na końcu inwazji (ryc. 7B). Blastopory Scaphechinus milabilis, który ma ciągłą inwaginację stają się wąskie pod koniec inwaginacji (Kominami i Masui, 1996). Dlatego też sugerujemy, że archenteron T. toreumaticus może również wydłużać się poprzez ciągłą ingresję komórek wokół blastoporu do blastocelu. U nieregularnych jeżowców z ciągłą inwaginacją, średnica archenteronu podczas inwaginacji nie zmienia się, tak więc rearanżacja komórek nie wpływa na wydłużanie się archenteronu (Kominami i Masui, 1996; Takata i Kominami, 2004). Jednakże zaobserwowaliśmy, że u T. toreumaticus średnica środkowego archenteronu i grubość ściany archenteronu gwałtownie się zmniejszały. Istnieje możliwość, że rearanżacja i wydłużenie komórek archenteronu powoduje wydłużenie archenteronu. U T. toreumaticus i nieregularnych jeżowców, wczesne wydarzenia rozwojowe, w tym ingresja PMCs, inicjacja inwazji archenteronu i formowanie SMCs, rozpoczynają się i kończą na stosunkowo wczesnych etapach. Sugeruje to, że wydarzenia rozwojowe mogą być przyspieszone i pominięte w całości, a następnie zaangażowane w ciągłą inwazję archenteronu. U tego gatunku SMCs i wydłużone filopodia powstaj± pod koniec inwazji, co oznacza, że SMCs mog± nie utwardzać archenteronu. Końcowy stopień inwazji wynosi około 94% (Rys. 5B), a pierwotne kanały porowe tego gatunku nie zachowują szerokości ciała (Kitazawa i in., 2014). Sugerujemy, że ciągła inwaginacja zachodzi poprzez elongację samego archenteronu.

W T. reevesii grubość ściany archenteronu zmniejszyła się po okresie lag (ryc. 5C). Sugeruje to, że elongacja komórek powoduje wydłużenie archenteronu. Średnica i grubość ściany archenteronu w środkowej części archenteronu uległa zmniejszeniu. Sugeruje to, że kolejny spadek był spowodowany rearanżacją komórek w archenteronie (ryc. 8D,E). Jest możliwe, że SMCs powodują wydłużenie archenteronu, ponieważ u tego gatunku występuje długi okres opóźnienia i okres inwazji wtórnej (Rys. 5C), a SMCs tworzą filopodia podczas inwazji wtórnej. Po inicjacji inwazji grubość wierzchołka archenteronu stawała się cienka czasowo tylko u tego gatunku (dane nie pokazane).

W T. hardwickii średnica blastoporu zmniejszała się od końca pierwszej inwazji do inicjacji inwazji wtórnej (ryc. 5D). Podobnie jak u S. milabilis (Kominami i Masui, 1996), wyniki sugerują, że to zmniejszenie u T. hardwickii może być spowodowane przez wzrost na biegunie zwierzęcym, który wypycha komórki na biegunie wegetatywnym, powodując wydłużenie archenteronu. Średnica środkowego archenteronu zmniejszyła się w okresie lag (Rys. 8F), co było spowodowane rearanżacją komórek archenteronu wzdłuż osi zwierzęco-wegetatywnej. Grubość ściany archenteronu była stała (ryc. 8G) i może to oznaczać, że wydłużanie się archenteronu nie jest spowodowane wydłużaniem się komórek, lecz ich rearanżacją. Podczas inaginacji wtórnej obserwowano SMC z filopodiami i jest możliwe, że to właśnie one powodują wydłużanie się archenteronu. Jednakże inwazja u T. hardwickii zakończyła się na około 60% długości całego zarodka, a SMCs zidentyfikowano tylko w pobliżu końca inwazji. Jest więc możliwe, że SMC z filopodiami nie powodują wydłużenia archenteronu, ale wzmacniają jego końcówkę w przypuszczalnej okolicy ustnej.

W M. globulus komórki archenteronu stawały się cienkie od końca okresu lag do rozpoczęcia inaginacji wtórnej (ryc. 8H, I). Takata i Kominami (2004) podali, że u M. globulus rearanżacja nie była znacząca. Końcówka archenteronu nie przylegała do płytki apikalnej, ani też SMCs nie rozpraszały się w blastocelu. Ponadto, liczba komórek archenteronu nie uległa zmianie. Sugeruje się zatem, że wydłużanie się komórek tworzących archenteron powoduje wydłużenie archenteronu. Średnica blastoporu zmniejszała się podczas inwazji (ryc. 7E), co oznacza, że wypychanie komórek wegetatywnych przez wzrost komórek zwierzęcych może powodować wydłużanie się archenteronu u tego gatunku.

Formowanie SMCs zachodziło w tym samym czasie u czterech badanych temnopleurydów. Jednakże trzy gatunki z inwazj± stopniow± potrzebowały dłuższego okresu inwazji niż gatunki z inwazj± ci±gł±, a ich ostateczny współczynnik inwazji wynosił około 60% (ryc. 5). Ich SMCs tworzyły filopodia podczas późnego okresu inaginacji (ryc. 5) i jest możliwe, że SMCs zmieniają kierunek wydłużania się archenteronu do przypuszczalnej okolicy ustnej poprzez utwardzanie końcówki archenteronu. Ponadto Amemiya et al. (1982) podali, że pseudopodia z SMCs mogą podciągać archenteron u H. pulcherrimus i P. depressus, ale nie u A. crassispina, ponieważ nie tworzy ona wielu pseudopodiów.

Średnice na końcu archenteronu wskazują na różne zmiany wśród gatunków (Ryc. 9). Wyniki te wskazują, że cecha na końcu archenteronu może powodować specyficzną dla gatunku inwazyjność lub proces formowania worków koelomicznych. Wniosek ten jest poparty ustaleniami, że wzór formowania pierwotnego kanału porowego z woreczków koelomicznych jest różny wśród tych gatunków (Kitazawa i in., 2012, 2014).

Nasze wyniki wskazują, że temnopleurydy mają gatunkowo specyficzne różnice podczas wczesnej morfogenezy, w tym formowania blastuli i inwazji archenteronu z uwzględnieniem efektywnych czynników z tej samej rodziny (tab. 1 i 2, ryc. 10). Temnopleurus toreumaticus wykształca pewne specyficzne dla gatunku cechy, takie jak pomarszczone jajo i pomarszczona blastula na wczesnych etapach rozwoju (Kitazawa i in., 2009, 2010). Analiza filogenetyczna oparta na danych allozymowych temnopleurydów sugeruje, że T. toreumaticus i T. reevesii są bliżej spokrewnione niż T. hardwickii i M. globulus (Matsuoka i Inamori, 1996). Jednakże, na podstawie analizy morfologicznej i molekularnej, Jeffery et al. (2003) ustalili, że M. globulus i T. reevesii są bliżej spokrewnione ze sobą niż z T. toreumaticus. Ostatnio obserwowaliśmy również rozwój innego temnopleuryda, Temnotrema sculptum i ten gatunek jest bardzo podobny do T. reevesii, T. hardwickii i M. globulus, ale nie do T. toreumaticus (Fujii i in., 2015). Dlatego stawiamy hipotezę, że po dywergencji T. toreumaticus wyewoluował więcej specyficzności gatunkowych na wczesnych etapach rozwoju niż inne temnopleurydy. Wciąż jednak pozostaje do odkrycia, dlaczego różnice w morfogenezie na wczesnych etapach rozwoju wyewoluowały w tej grupie, mimo że gatunki te wykazują bardzo podobne cechy, takie jak wielkość jaj, ogólne tempo rozwoju czy morfologia larw. Istnieje możliwość, że pewne różnice w podstawowych konserwowanych wydarzeniach rozwojowych na wczesnych etapach rozwoju wśród temnopleurydów mogą się akumulować poprzez losowy dryf, o ile nie zakłócają ogólnego rozwoju poprzez dryf systemów rozwojowych, jak proponują True i Haag (2001).