Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego

Próbkę NMR przygotowuje się w cienkościennej szklanej probówce – probówce NMR.

Częstotliwość rezonansowaEdit

Po umieszczeniu w polu magnetycznym jądra aktywne NMR (takie jak 1H lub 13C) absorbują promieniowanie elektromagnetyczne o częstotliwości charakterystycznej dla danego izotopu. Częstotliwość rezonansowa, energia zaabsorbowanego promieniowania i intensywność sygnału są proporcjonalne do natężenia pola magnetycznego. Na przykład, w polu magnetycznym o natężeniu 21 Tesli jądra wodoru (potocznie zwane protonami) rezonują z częstotliwością 900 MHz. Powszechne jest określanie magnesu 21 T jako magnesu 900 MHz, ponieważ wodór jest najczęściej wykrywanym jądrem, jednakże różne jądra będą rezonować z różnymi częstotliwościami przy tym natężeniu pola, proporcjonalnie do ich magnetycznych momentów jądrowych.

Obsługa próbkiEdit

Spektrometr NMR składa się zazwyczaj z wirującego uchwytu na próbkę wewnątrz bardzo silnego magnesu, emitera częstotliwości radiowej i odbiornika z sondą (zespół anteny), która wchodzi do magnesu, aby otoczyć próbkę, opcjonalnie cewek gradientowych do pomiarów dyfuzji i elektroniki do sterowania systemem. Obracanie próbki jest zwykle konieczne do uśrednienia ruchu dyfuzyjnego, jednak niektóre eksperymenty wymagają nieruchomej próbki, gdy ruch roztworu jest ważną zmienną. Na przykład, pomiary stałych dyfuzji (uporządkowana spektroskopia dyfuzji lub DOSY) są wykonywane przy użyciu stacjonarnej próbki z wyłączonym wirowaniem, a komórki przepływowe mogą być używane do analizy online przepływów procesowych.

Deuterowane rozpuszczalnikiEdit

Ogromna większość cząsteczek w roztworze to cząsteczki rozpuszczalnika, a większość zwykłych rozpuszczalników to węglowodory, a więc zawierają protony aktywne w NMR. Aby uniknąć wykrywania sygnałów pochodzących wyłącznie od atomów wodoru w rozpuszczalniku, stosuje się deuterowane rozpuszczalniki, w których 99+% protonów jest zastąpionych deuterem (wodór-2). Najpowszechniej stosowanym deuterowanym rozpuszczalnikiem jest deuterochloroform (CDCl3), chociaż z różnych powodów, takich jak rozpuszczalność próbki, chęć kontrolowania wiązania wodorowego, temperatury topnienia lub wrzenia, mogą być stosowane inne rozpuszczalniki. Przesunięcia chemiczne cząsteczki będzie zmieniać się nieznacznie między rozpuszczalnikami, a rozpuszczalnik używany będzie prawie zawsze zgłaszane z przesunięć chemicznych. Widma NMR są często kalibrowane względem znanego piku protonu resztkowego rozpuszczalnika zamiast dodanego tetrametylosilanu.

Wyrównaj i zablokujEdit

Aby wykryć bardzo małe przesunięcia częstotliwości spowodowane magnetycznym rezonansem jądrowym, przyłożone pole magnetyczne musi być stałe w całej objętości próbki. Spektrometry NMR o wysokiej rozdzielczości wykorzystują podkładki regulacyjne, aby dostosować jednorodność pola magnetycznego do części na miliard (ppb) w objętości kilku centymetrów sześciennych. W celu wykrycia i skompensowania niejednorodności i dryftu w polu magnetycznym, spektrometr utrzymuje „blokadę” na częstotliwości deuteru rozpuszczalnika z oddzielną jednostką blokady, która jest zasadniczo dodatkowym nadajnikiem i procesorem RF dostrojonym do jądra blokady (deuteru), a nie jąder próbki zainteresowania. W nowoczesnych spektrometrach NMR regulacja podkładki odbywa się automatycznie, choć w niektórych przypadkach operator musi ręcznie optymalizować parametry podkładki, aby uzyskać najlepszą możliwą rozdzielczość

Akwizycja widmEdit

Po wzbudzeniu próbki impulsem o częstotliwości radiowej (60-1000 MHz) uzyskuje się odpowiedź magnetycznego rezonansu jądrowego – rozpad swobodnej indukcji (FID). Jest to bardzo słaby sygnał i wymaga czułych odbiorników radiowych. Transformacja Fouriera jest przeprowadzana w celu wyodrębnienia widma w dziedzinie częstotliwości z surowego widma FID w dziedzinie czasu. Widmo z pojedynczego FID ma niski stosunek sygnału do szumu, ale poprawia się łatwo z uśrednianiem powtarzających się akwizycji. Dobre widma 1H NMR mogą być uzyskane z 16 powtórzeń, co zajmuje tylko kilka minut. Jednakże, dla pierwiastków cięższych od wodoru, czas relaksacji jest raczej długi, np. około 8 sekund dla 13C. W związku z tym, akwizycja ilościowych widm ciężkich pierwiastków może być czasochłonna i trwać od kilkudziesięciu minut do kilku godzin.

Po impulsie, jądra są średnio wzbudzone do pewnego kąta względem pola magnetycznego spektrometru. Zakres wzbudzenia może być kontrolowany szerokością impulsu, typowo ok. 3-8 µs dla optymalnego impulsu 90°. Szerokość impulsu może być określona przez wykreślenie (podpisanej) intensywności w funkcji szerokości impulsu. Jest ona zgodna z krzywą sinusoidalną i odpowiednio zmienia znak przy szerokościach impulsu odpowiadających impulsom 180° i 360°.

Czasy zaniku wzbudzenia, zwykle mierzone w sekundach, zależą od efektywności relaksacji, która jest szybsza dla lżejszych jąder i w ciałach stałych, a wolniejsza dla cięższych jąder i w roztworach, a w gazach mogą być bardzo długie. Jeśli drugi impuls wzbudzający zostanie wysłany przedwcześnie, przed zakończeniem relaksacji, średni wektor magnetyzacji nie rozpadł się do stanu podstawowego, co wpływa na siłę sygnału w nieprzewidywalny sposób. W praktyce, powierzchnie pików nie są wtedy proporcjonalne do stechiometrii; możliwe jest jedynie rozróżnienie obecności, ale nie ilości grup funkcyjnych. Eksperyment z odzyskaniem inwersji może być przeprowadzony w celu określenia czasu relaksacji i tym samym wymaganego opóźnienia pomiędzy impulsami. Wysyłany jest impuls 180°, regulowane opóźnienie i impuls 90°. Kiedy impuls 90° dokładnie znosi sygnał, opóźnienie odpowiada czasowi potrzebnemu do 90° relaksacji. Inversion recovery jest warte uwagi w przypadku ilościowych badań 13C, 2D i innych czasochłonnych eksperymentów.

Przesunięcie chemiczneEdit

Wirujący ładunek generuje pole magnetyczne, które powoduje powstanie momentu magnetycznego proporcjonalnego do spinu. W obecności zewnętrznego pola magnetycznego istnieją dwa stany spinowe (dla jądra o spinie 1/2): jeden spin w górę i jeden w dół, gdzie jeden jest zgodny z polem magnetycznym, a drugi mu się przeciwstawia. Różnica energii (ΔE) pomiędzy dwoma stanami spinowymi wzrasta wraz ze wzrostem natężenia pola, ale różnica ta jest zazwyczaj bardzo mała, co prowadzi do konieczności stosowania silnych magnesów NMR (1-20 T w nowoczesnych aparatach NMR). Napromieniowanie próbki energią odpowiadającą dokładnej separacji stanów spinowych określonego zestawu jąder spowoduje wzbudzenie tego zestawu jąder w stanie o niższej energii do stanu o wyższej energii.

Dla jąder o spinie 1/2 różnica energii pomiędzy dwoma stanami spinowymi przy danym natężeniu pola magnetycznego jest proporcjonalna do ich momentu magnetycznego. Jednakże, nawet jeśli wszystkie protony mają takie same momenty magnetyczne, nie dają sygnałów rezonansowych o tych samych wartościach częstotliwości. Różnica ta wynika z różnych środowisk elektronicznych interesującego nas jądra. Po przyłożeniu zewnętrznego pola magnetycznego, elektrony te poruszają się w odpowiedzi na pole i generują lokalne pola magnetyczne, które przeciwstawiają się znacznie silniejszemu przyłożonemu polu. To lokalne pole w ten sposób „osłania” proton od przyłożonego pola magnetycznego, które musi być zwiększone w celu osiągnięcia rezonansu (absorpcji energii rf). Takie przyrosty są bardzo małe, zwykle w częściach na milion (ppm). Na przykład, pik protonowy aldehydu jest przesunięty o około 10 ppm w porównaniu do piku węglowodorowego, ponieważ jako grupa odbierająca elektrony, karbonyl deshieldsuje proton poprzez zmniejszenie lokalnej gęstości elektronowej. Różnica pomiędzy 2.3487 T i 2.3488 T wynosi zatem około 42 ppm. Jednakże skala częstotliwości jest powszechnie stosowana do oznaczania sygnałów NMR, mimo że spektrometr może działać poprzez przemiatanie pola magnetycznego, a zatem 42 ppm to 4200 Hz dla częstotliwości odniesienia (rf) 100 MHz.

Jednakże, biorąc pod uwagę, że położenie różnych sygnałów NMR zależy od natężenia zewnętrznego pola magnetycznego i częstotliwości odniesienia, sygnały są zwykle podawane względem sygnału odniesienia, zwykle sygnału TMS (tetrametylosilanu). Dodatkowo, ponieważ rozkład sygnałów NMR jest zależny od pola, częstotliwości te są dzielone przez częstotliwość spektrometru. Ponieważ jednak dzielimy Hz przez MHz, otrzymana liczba byłaby zbyt mała, dlatego jest mnożona przez milion. Ta operacja daje zatem liczbę lokalizatora zwaną „przesunięciem chemicznym” z jednostkami części na milion. Ogólnie rzecz biorąc, przesunięcia chemiczne dla protonów są bardzo przewidywalne, ponieważ są one przede wszystkim zdeterminowane przez prostsze efekty ekranowania (gęstość elektronów), ale przesunięcia chemiczne dla wielu cięższych jąder są silniej uzależnione od innych czynników, w tym stanów wzbudzonych (wkład „paramagnetyczny” do tensora ekranowania).

Przykład przesunięcia chemicznego: Widmo NMR heksaboranu B6H10 pokazujące piki przesunięte w częstotliwości, które dają wskazówki co do struktury molekularnej. (kliknij, aby przeczytać szczegóły interpretacji)

Przesunięcie chemiczne dostarcza informacji o strukturze cząsteczki. Zamiana surowych danych na te informacje nazywana jest przypisywaniem widma. Na przykład, dla widma 1H-NMR dla etanolu (CH3CH2OH), należałoby oczekiwać sygnałów przy każdym z trzech określonych przesunięć chemicznych: jeden dla grupy CH3, jeden dla grupy CH2 i jeden dla grupy OH. Typowa grupa CH3 ma przesunięcie około 1 ppm, CH2 dołączony do OH ma przesunięcie około 4 ppm i OH ma przesunięcie w dowolnym miejscu od 2-6 ppm w zależności od użytego rozpuszczalnika i ilości wiązania wodorowego. Podczas gdy atom O pobiera gęstość elektronów z dala od dołączonego H poprzez ich wzajemne wiązanie sigma, samotne pary elektronów na O kąpią H w ich efekcie ekranowania.

W paramagnetycznej spektroskopii NMR, pomiary są prowadzone na próbkach paramagnetycznych. Paramagnetyzm powoduje, że przesunięcia chemiczne są bardzo zróżnicowane. W spektroskopii 1H NMR, zakres przesunięcia chemicznego może obejmować do tysięcy ppm.

Z powodu ruchu cząsteczek w temperaturze pokojowej, trzy protony metylowe uśredniają się podczas eksperymentu NMR (który zazwyczaj trwa kilka ms). Protony te stają się zdegenerowane i tworzą pik przy tym samym przesunięciu chemicznym.

Kształt i obszar pików są również wskaźnikami struktury chemicznej. W powyższym przykładzie – widmo protonowe etanolu – pik CH3 ma trzykrotnie większą powierzchnię niż pik OH. Podobnie pik CH2 będzie miał dwukrotnie większą powierzchnię niż pik OH, ale tylko 2/3 powierzchni piku CH3.

Oprogramowanie pozwala na analizę intensywności sygnału pików, które w warunkach optymalnej relaksacji korelują z liczbą protonów danego typu. Analiza intensywności sygnału odbywa się poprzez całkowanie – proces matematyczny, który oblicza pole powierzchni pod krzywą. Analityk musi integrować pik, a nie mierzyć jego wysokość, ponieważ piki mają również szerokość – a więc jego wielkość zależy od jego powierzchni, a nie wysokości. Należy jednak wspomnieć, że liczba protonów, lub innych obserwowanych jąder, jest proporcjonalna do intensywności, lub całki, sygnału NMR tylko w najprostszych jednowymiarowych eksperymentach NMR. W bardziej skomplikowanych eksperymentach, na przykład w eksperymentach typowych dla widm węgla-13 NMR, całka sygnału zależy od szybkości relaksacji jądra, jego stałych sprzężenia skalarnego i dipolarnego. Bardzo często czynniki te są słabo znane – dlatego całka sygnału NMR jest bardzo trudna do interpretacji w bardziej skomplikowanych eksperymentach NMR.

J-couplingEdit

Przykładowe widmo 1H NMR (jednowymiarowe) etanolu wykreślone jako intensywność sygnału w funkcji przesunięcia chemicznego. przesunięcie chemiczne. Istnieją trzy różne typy atomów H w etanolu w odniesieniu do NMR. Wodór (H) na grupie -OH nie sprzęga się z innymi atomami H i pojawia się jako singlet, ale hydrogeny CH3- i -CH2- sprzęgają się ze sobą, dając odpowiednio tryplet i kwartet.

Niektóre z najbardziej użytecznych informacji do określenia struktury w jednowymiarowym widmie NMR pochodzą ze sprzężenia J lub sprzężenia skalarnego (specjalny przypadek sprzężenia spin-spin) pomiędzy aktywnymi jądrami NMR. Sprzężenie to powstaje w wyniku oddziaływania różnych stanów spinowych poprzez wiązania chemiczne w cząsteczce i powoduje rozszczepienie sygnałów NMR. Dla protonu, lokalne pole magnetyczne jest nieco inne w zależności od tego, czy sąsiednie jądro jest skierowane w stronę pola magnetycznego spektrometru, czy przeciwnie, co powoduje powstanie dwóch sygnałów na proton zamiast jednego. Te wzory rozszczepienia mogą być złożone lub proste i podobnie, mogą być prosto interpretowalne lub mylące. Sprzężenie to dostarcza szczegółowego wglądu w połączenia atomów w cząsteczce.

Sprzężenie z n równoważnymi (spin ½) jądrami rozszczepia sygnał na n+1 multipletu o stosunkach intensywności zgodnych z trójkątem Pascala, jak opisano po prawej stronie. Sprzężenie z dodatkowymi spinami prowadzi do dalszego rozszczepienia każdej składowej multipletów, np. sprzężenie z dwoma różnymi jądrami o spinie ½ o znacząco różnych stałych sprzężenia prowadzi do powstania dubletu dubletów (skrót: dd). Należy zauważyć, że sprzężenie pomiędzy jądrami, które są równoważne chemicznie (czyli mają takie samo przesunięcie chemiczne) nie ma wpływu na widma NMR, a sprzężenia pomiędzy jądrami, które są odległe (zwykle więcej niż 3 wiązania od siebie dla protonów w elastycznych cząsteczkach) są zwykle zbyt małe, aby powodować obserwowalne rozszczepienia. W związkach cyklicznych i aromatycznych często można zaobserwować sprzężenia dalekiego zasięgu, przekraczające trzy wiązania, co prowadzi do bardziej złożonych wzorów rozszczepienia.

Na przykład, w opisanym powyżej widmie protonów dla etanolu, grupa CH3 jest rozszczepiona na tryplet o stosunku intensywności 1:2:1 przez dwa sąsiadujące protony CH2. Podobnie, grupa CH2 jest rozszczepiona na kwartet o stosunku intensywności 1:3:3:1 przez trzy sąsiadujące protony CH3. W zasadzie, dwa protony CH2 byłby również podzielony ponownie w dublet, aby utworzyć dublet kwartetów przez proton hydroksylowy, ale międzycząsteczkowej wymiany kwaśnego protonu hydroksylowego często powoduje utratę informacji sprzężenia.

Sprzęganie do dowolnego spin-1/2 jąder, takich jak fosfor-31 lub fluor-19 działa w ten sposób (chociaż wielkości stałych sprzężenia mogą być bardzo różne). Jednak wzory rozszczepienia różnią się od tych opisanych powyżej dla jąder o spinie większym niż ½, ponieważ spinowa liczba kwantowa ma więcej niż dwie możliwe wartości. Na przykład, sprzężenie z deuterem (jądro o spinie 1) rozszczepia sygnał na tryplet 1:1:1, ponieważ spin 1 ma trzy stany spinowe. Podobnie, jądro o spinie 3/2 takie jak 35Cl rozdziela sygnał na kwartet 1:1:1:1 i tak dalej.

Sprzężenie w połączeniu z przesunięciem chemicznym (i całkowaniem dla protonów) mówi nam nie tylko o środowisku chemicznym jąder, ale także o liczbie sąsiednich aktywnych jąder NMR w cząsteczce. W bardziej złożonych widmach z wieloma pikami przy podobnych przesunięciach chemicznych lub w widmach jąder innych niż wodór, sprzężenie jest często jedynym sposobem na rozróżnienie różnych jąder.

Widmo 1H NMR mentolu z przesunięciem chemicznym w ppm na osi poziomej. Każdy magnetycznie nierównoważny proton ma charakterystyczne przesunięcie, a sprzężenia z innymi protonami pojawiają się jako rozszczepienie pików na multiplety: np. pik a, z powodu trzech magnetycznie równoważnych protonów w grupie metylowej a, sprzęga się z jednym sąsiednim protonem (e) i dlatego pojawia się jako dublet.

Sprzężenie drugiego rzędu (lub silne)Edit

Powyższy opis zakłada, że stała sprzężenia jest mała w porównaniu z różnicą w częstotliwościach NMR pomiędzy spinami nierównoważnymi. Jeśli separacja przesunięć maleje (lub siła sprzężenia rośnie), wzory intensywności multipletów są najpierw zniekształcone, a następnie stają się bardziej złożone i mniej łatwe do analizy (szczególnie jeśli zaangażowane są więcej niż dwa spiny). Intensyfikacja niektórych pików w multiplecie jest osiągana kosztem pozostałych, które czasami prawie znikają w szumie tła, chociaż zintegrowana powierzchnia pod pikami pozostaje stała.W większości wysokopolowych NMR, jednakże, zniekształcenia są zwykle skromne i charakterystyczne zniekształcenia (zadaszenia) mogą w rzeczywistości pomóc w identyfikacji powiązanych pików.

Niektóre z tych wzorów mogą być analizowane metodą opublikowaną przez Johna Pople’a, choć ma ona ograniczony zakres.

Efekty drugiego rzędu zmniejszają się wraz ze wzrostem różnicy częstotliwości pomiędzy multipletami, tak więc widma NMR o wysokim polu (tj. wysokiej częstotliwości) wykazują mniejsze zniekształcenia niż widma o niższej częstotliwości. Wczesne widma przy 60 MHz były bardziej podatne na zniekształcenia niż widma z późniejszych urządzeń działających zazwyczaj przy częstotliwościach 200 MHz lub wyższych.

Ponadto, jak na rysunku po prawej, sprzężenie J może być użyte do identyfikacji podstawienia orto-meta-para pierścienia. Orto sprzężenie jest najsilniejsze przy 15 Hz, Meta następuje ze średnią 2 Hz, i wreszcie para sprzężenie jest zwykle nieistotne dla badań.

Nierównoważność magnetycznaEdit

Subtelniejsze efekty mogą wystąpić, jeśli chemicznie równoważne spiny (tj. jądra powiązane przez symetrię, a więc mające tę samą częstotliwość NMR) mają różne relacje sprzężenia do spinów zewnętrznych. Spiny, które są chemicznie równoważne, ale nie są nierozróżnialne (na podstawie ich relacji sprzężenia) są określane jako magnetycznie nierównoważne.Na przykład, miejsca 4 H 1,2-dichlorobenzenu dzielą się na dwie chemicznie równoważne pary przez symetrię, ale indywidualny członek jednej z par ma różne sprzężenia do spinów tworzących drugą parę.Magnetyczna nierównoważność może prowadzić do bardzo złożonych widm, które mogą być analizowane tylko przez modelowanie obliczeniowe. Takie efekty są bardziej powszechne w widmach NMR aromatycznych i innych nieelastycznych układów, podczas gdy uśrednianie konformacyjne wokół wiązań C-C w elastycznych cząsteczkach ma tendencję do wyrównywania sprzężeń między protonami na sąsiednich węglach, redukując problemy z magnetyczną nierównoważnością.